李慧娟，孫云鵬，丁鵬程，2，丁瑞，吳光坤，李泉

1(山東科技大學化學與環(huán)境工程學院，山東青島，266590)2(山東大學生命科學學院，山東濟南，250100)

豆粕是大豆榨油后的副產(chǎn)物，其蛋白質(zhì)含量高達40%～50%，是目前畜牧養(yǎng)殖業(yè)中常用的飼料。但因豆粕中含有胰蛋白酶抑制劑、大豆凝集素、大豆抗原蛋白(致敏因子)等多種抗營養(yǎng)因子，對動物的生長發(fā)育和健康造成不良影響［1］。通過蛋白酶的作用可減弱食物蛋白的抗原影響，水解產(chǎn)生的小肽不僅具有抗氧化和抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性，產(chǎn)生的游離氨基酸還可改善產(chǎn)物的風味［2-4］。在工業(yè)生產(chǎn)中常用酶法和發(fā)酵法處理豆粕，使其大分子蛋白降解成小分子肽(大豆肽)，由此可以破壞豆粕中的大多數(shù)抗營養(yǎng)因子，提高豆粕的消化、吸收和利用率［2，5-6］。酶法酶解豆粕制備大豆肽，因酶價格較高而使生產(chǎn)成本增加，且存在著產(chǎn)物得率不高的問題;而微生物發(fā)酵處理豆粕，一方面微生物在發(fā)酵過程中分泌的蛋白酶可降解豆粕形成小分子肽，有效降解其中的抗營養(yǎng)因子，另一方面微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一些次級代謝產(chǎn)物還能有效改善大豆肽的風味［7-8］。固體發(fā)酵具有低能耗、節(jié)水、發(fā)酵產(chǎn)物穩(wěn)定性較高、對無菌條件要求低、易加工等特點，有助于工業(yè)化生產(chǎn)［9］。關(guān)于混合菌固態(tài)發(fā)酵豆粕的工藝優(yōu)化和大豆肽生理活性等方面的報道很多［1，7-8］，而結(jié)合生產(chǎn)實際對混合菌固體發(fā)酵工藝及發(fā)酵產(chǎn)物生理活性進行系統(tǒng)研究的報道較少，加強此方面的研究對降低大豆肽生產(chǎn)成本，提高大豆肽得率和產(chǎn)品品質(zhì)，具有重要意義。

本文以實驗室篩選的產(chǎn)蛋白酶菌株(枯草芽孢桿菌)和植物乳桿菌對大豆豆粕進行混合菌固態(tài)發(fā)酵，以小肽含量和揮發(fā)性鹽基氮含量為檢測指標，系統(tǒng)研究了菌種配比、料水比、接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間等單因素對固態(tài)發(fā)酵豆粕的影響，確定最佳的固態(tài)發(fā)酵工藝;并對發(fā)酵得到的大豆肽進行抗氧化和氨基酸成分分析。本研究將有助于豆粕的高值化開發(fā)及應用。

1 材料與方法

1.1 材料、主要化學試劑及培養(yǎng)基

1.1.1 實驗材料

豆粕:市場購買，粗蛋白質(zhì)含量43.54%(實測)。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis J3)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum JNX):本實驗室保存。

1.1.2 主要化學試劑及培養(yǎng)基

ABTS ［2，2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)］:2，2-二氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)

枯草芽孢桿菌(B.subtilis J3)的種子培養(yǎng)基(w/v):蛋白胨1%，牛肉浸粉0.3%，NaCl 0.5%。

枯草芽孢桿菌(B.subtilis J3)的發(fā)酵培養(yǎng)基(w/v):玉米芯 0.5%，大豆豆粕 3.4%，K2HPO40.34%，(NH4)2SO40.2%，CaCO30.2%，pH 8.0。

植物乳桿菌(L.plantarum JNX)的種子培養(yǎng)基(w/v):蛋白胨 1%，牛肉浸粉 1%，酵母提取物0.5%，葡萄糖 2%，乙酸鈉 0.5%，檸檬酸氫二銨0.2%，K2HPO40.2%，吐溫 -80 0.1%，pH 7.0。

植物乳桿菌(L.plantarum JNX)發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖4%，蛋白胨1%，酵母提取物1%，乙酸鈉0.5%，Tween-80 0.15%，pH 5.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 固態(tài)發(fā)酵工藝流程

用種子培養(yǎng)基分別活化枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌，按1%接種量接種到相應的發(fā)酵培養(yǎng)基中，將在30℃170 r/min振蕩培養(yǎng)20 h后的菌液接種到固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，從菌種配比(1∶1，1∶2，2∶1)、料水比(1∶0.4，1∶0.6，1∶0.8，1∶1，1∶1.2)、接種量(3%，6%，9%，12%)、發(fā)酵溫度(25，30，35，40℃)和發(fā)酵時間(12，24，36，48，60 h)等5個因素進行發(fā)酵工藝優(yōu)化，其中在菌種配比、料水比、接種量單因素優(yōu)化時，發(fā)酵溫度為30℃、發(fā)酵時間為24 h。發(fā)酵完成后測定發(fā)酵產(chǎn)物中的小肽含量和揮發(fā)性鹽基氮含量。

1.2.1.1 小肽含量的測定

發(fā)酵產(chǎn)物中酸溶蛋白的含氮量測定:稱取發(fā)酵產(chǎn)物10 g，加入15% 三氯乙酸溶液60 mL溶解并定容至100 mL。10 000 r/min離心20 min，取上清液10 mL，放入凱斯燒瓶中，采用凱氏定氮法測定含氮量，具體操作和計算參照 GBT 6432-1994［10］的測定方法。豆粕中含氮量的測定:稱取豆粕0.5 g加入到干燥的凱斯燒瓶中進行如上所述操作。

1.2.1.2 揮發(fā)性鹽基氮含量的測定

稱取10 g發(fā)酵產(chǎn)物置于含100 mL蒸餾水的燒杯中，于磁力攪拌器上攪拌30 min后，倒入離心管中，10 000 r/min離心20 min，取10 mL上清液采用半微量定氮法測定揮發(fā)性鹽基氮的含量，具體操作和計算參照 GB/T 5009.44-2003［11］。

1.2.2 發(fā)酵產(chǎn)物中大豆活性肽的抗氧化活性測定

稱取10 g發(fā)酵產(chǎn)物于含100 mL蒸餾水的燒杯中，經(jīng)磁力攪拌器攪拌30 min后，倒入離心管中，10 000 r/min離心20 min后取上清，適量稀釋成為待測液(大豆活性肽)，利用ABTS法［12］測定大豆肽的抗氧化活性，將大豆肽樣品換成蒸餾水作為對照，計算多肽的抗氧化活性?？寡趸钚杂孟蕘肀硎?。

式中，A0:ABTS+工作液的吸光度;A:待測液與ABTS+工作溶液反應時的吸光度。

1.2.3 發(fā)酵產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳

取發(fā)酵后的豆粕用蒸餾水溶解、浸提、離心取上清液，具體操作同1.2.2，上清液用于SDS-PAGE電泳(15%的分離膠，5%的濃縮膠，電泳的電壓200 V)。以未發(fā)酵的豆粕提取液為對照。

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)物的氨基酸組成成分分析

分別稱取未接菌的豆粕和接菌的豆粕在30℃培養(yǎng)箱中固體發(fā)酵48 h后的產(chǎn)物10 g溶于100 mL蒸餾水中，于磁力攪拌器上攪拌30 min后，離心取上清液。取1 mL上清液用6 mol/L HCl 110℃水解24 h后，調(diào)pH至2.2，利用L8900型氨基酸自動分析儀檢測氨基酸組成成分及含量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 混合菌固體發(fā)酵豆粕的條件優(yōu)化

2.1.1 菌種配比對發(fā)酵產(chǎn)物的影響

圖1 植物乳桿菌與枯草芽孢桿菌配比對發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量與揮發(fā)性鹽基氮含量的影響Fig.1 Effect the ratio of L.plantarum JNX and B.subtilis J3 on the content of small peptides and volatile basic nitrogen in fermented products

稱取20 g豆粕加入250 mL的錐形瓶中，料水比選為1∶1，混合菌的接種量為6%，植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌菌種設置不同配比進行固體發(fā)酵。圖1表明，在植物乳酸桿菌接種量一定的情況下，增加枯草芽孢桿菌的接種量 (菌株配比從1∶1至1∶2)，發(fā)酵產(chǎn)物的小肽含量明顯增加，從6.38%增加到10.13%;但發(fā)酵產(chǎn)物的揮發(fā)性鹽基氮含量亦從65.91 mg/100 g增加至84.74 mg/100 g。揮發(fā)性鹽基氮含量反映了發(fā)酵豆粕的氨基酸損失和腐敗程度，在發(fā)酵生產(chǎn)中應控制其含量在盡可能低的范圍內(nèi)［1］，而在增加菌種配比中植物乳桿菌的比例(2∶1)情況下接種，發(fā)酵產(chǎn)物小肽含量為7.32%，高于1∶1菌株配比下發(fā)酵產(chǎn)物的小肽含量;同時揮發(fā)性鹽基氮含量降低至56.51 mg/100 g。因此選擇植物乳桿菌與枯草芽孢桿菌菌種配比為 2∶1。

2.1.2 料水比對發(fā)酵產(chǎn)物的影響

稱取20 g豆粕加入250 mL的錐形瓶中，混合菌(植物乳桿菌與枯草芽孢桿菌菌種配比為2∶1)的接種量為6%，設置不同的料水比進行固態(tài)發(fā)酵。控制料水比是固態(tài)發(fā)酵過程中重要環(huán)節(jié)之一，過高的含水量影響氧的傳遞，限制好氧菌的生長;過低的含水量，抑制菌體的生長，影響酶的活性［9］。由圖2可以看出，隨著料水比的增加，小肽含量和揮發(fā)性鹽基氮含量的總體變化趨勢均為先增加后減少，在料水比為1∶0.6時，小肽含量達到最大值(10.48%)，揮發(fā)性鹽基氮含量也最低(52.43 mg/100 g)。因此確定最佳料水比為 1∶0.6。

圖2 料水比對發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量與揮發(fā)性鹽基氮含量的影響Fig.2 Effect the ratio of material to water on the content of small peptides and volatile basic nitrogen in fermented products

2.1.3 接種量對發(fā)酵產(chǎn)物的影響

稱取20 g豆粕加入250 mL的錐形瓶中，料水比為1∶0.6，設置不同的接種量進行固態(tài)發(fā)酵，結(jié)果見圖3。

圖3 接種量對發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量與揮發(fā)性鹽基氮含量的影響Fig.3 Effect inoculum size on the content of small peptides and volatile basic nitrogen in fermented products

由圖3可知，隨著接種量的增加，小肽含量和揮發(fā)性鹽基氮含量均增加，接種量12%時，小肽含量雖高達12.75%，但揮發(fā)性鹽基氮含量也高達98.37 mg/100 g，遠超過生產(chǎn)中對揮發(fā)性鹽基氮含量的最低要求。混合菌的接種量高，所產(chǎn)蛋白酶含量和活力高，使豆粕中更多的蛋白質(zhì)降解為小肽，增加了小肽的含量;但是，菌體在固體發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝副產(chǎn)物也相應增加，揮發(fā)性鹽基氮含量的增高將嚴重影響發(fā)酵豆粕的品質(zhì)，合格植物肽蛋白飼料中揮發(fā)性鹽基氮含量應控制在50 mg/100 g以下［1］。接種量6%的發(fā)酵產(chǎn)物中揮發(fā)性鹽基氮含量最低，僅為50.77 mg/100 g;小肽含量為 10.02%，僅比最高值(12.75%)下降了2.73%。綜合考慮確定最適接種量為6%。

2.1.4 發(fā)酵溫度對發(fā)酵產(chǎn)物的影響

稱取20 g豆粕加入250 mL的錐形瓶中，料水比為1∶0.6，混合菌接種量為6%，分別置于不同溫度下固體發(fā)酵24 h。溫度不僅影響微生物的生長而且影響酶的活性，因固態(tài)發(fā)酵傳熱性差，故選擇合適的發(fā)酵溫度而使發(fā)酵反應進行下去變得尤為重要。由圖4可以看出，小肽含量和揮發(fā)性鹽基氮含量的總體變化趨勢是隨著溫度的升高而增加。發(fā)酵溫度為40℃時，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量達到最高，為11.17%，而揮發(fā)性鹽基氮含量也高達92.03 mg/100 g。揮發(fā)性鹽基氮過高不僅使發(fā)酵的豆粕產(chǎn)生氨臭味、適口性變差，嚴重的會導致動物中毒［1］。當溫度為30℃時，揮發(fā)性鹽基氮含量僅為57.12 mg/100 g，且小肽含量略低于最高值，為9.57%。綜合考慮確定最適發(fā)酵溫度為30℃。

圖4 發(fā)酵溫度對發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量與揮發(fā)性鹽基氮含量的影響Fig.4 Effect fermentation temperature on the content of small peptides and volatile basic nitrogen in fermented products

2.1.5 發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)物的影響

稱取20 g豆粕加入250 mL的錐形瓶中，料水比1∶0.6，混合菌接種量6%，于30℃培養(yǎng)箱中固體發(fā)酵不同時間。由圖5可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，菌群大量生長，蛋白酶活性增高，小肽的產(chǎn)量逐漸上升，但隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵副產(chǎn)物增多，揮發(fā)性鹽基氮含量也增加，降低了發(fā)酵產(chǎn)物的品質(zhì)。發(fā)酵24 h時，揮發(fā)性鹽基氮含量最低，為50.70 mg/100 g;相對應的小肽含量為10.64%，略低于發(fā)酵48 h的小肽含量(12.76%)。實驗中也發(fā)現(xiàn)發(fā)酵48 h后，豆粕有些稀濕粘連，不利于產(chǎn)品的后續(xù)加工，也不利于菌體的生長。綜合考慮確定最適發(fā)酵周期為24 h。

圖5 發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量與揮發(fā)性鹽基氮含量的影響Fig.5 Effect fermentation time on the content of small peptides and volatile basic nitrogen in fermented products

2.2 混合菌固態(tài)發(fā)酵豆粕所制備大豆活性肽的抗氧化活性

稱取20 g豆粕加入250 mL的錐形瓶中，料水比1∶0.6，接入6%混合菌菌液，30℃培養(yǎng)箱中固態(tài)發(fā)酵。水浸提法提取大豆活性肽，利用ABTS法［12］測定大豆肽的抗氧化活性。對照組不接菌，其余同實驗組，實驗結(jié)果見圖6。

圖6 不同發(fā)酵時間下發(fā)酵產(chǎn)物中大豆肽的抗氧化活性變化趨勢Fig.6 Time course of antioxidant activity of soybean peptides in fermented products

由圖6可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，對照組的ABTS清除自由基能力基本在14.79%～20.17%之間;而在實驗組中不同發(fā)酵時間所提取的大豆肽，其清除自由基能力均在40%以上，隨著發(fā)酵時間的延長，所提取大豆肽的清除自由基能力提高，這與小肽含量變化規(guī)律(圖5)相吻合。固態(tài)發(fā)酵48 h時，所提取大豆肽的清除自由基能力最高，為65.76%。參與清除自由基的抗氧化肽的分離、純化及其氨基酸組成成分分析有待進一步深入地探討。

2.3 發(fā)酵產(chǎn)物的電泳分析

由SDS-PAGE電泳圖(圖7)可以看出，豆粕在枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌混合菌的最適發(fā)酵工藝條件下，隨發(fā)酵時間延長，大分子質(zhì)量的豆粕被降解，發(fā)酵24 h后，發(fā)酵豆粕中所提取的大豆肽分子質(zhì)量主要在10 kDa以下，這與龐宗文等［8］用毛霉發(fā)酵豆粕和ZHU等［13］用枯草芽孢桿菌發(fā)酵傳統(tǒng)豆制品的實驗結(jié)果相類似。

圖7 發(fā)酵產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖Fig.7 SDS-PAGE profile of fermentation products

2.4 發(fā)酵產(chǎn)物的氨基酸組成成分分析

將未接菌的(對照組)和接菌的(實驗組)豆粕在30℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵48 h，其發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)酸水解后測定氨基酸組成成分及其含量，實驗結(jié)果表明混合菌發(fā)酵后的氨基酸含量均高于未接菌的，其中脯氨酸高出16倍、甲硫氨酸高出14倍;而且甲硫氨酸、亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和異亮氨酸等必需氨基酸的含量均高于未發(fā)酵的豆粕提取液5倍以上(見表1)。已有的研究表明組氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸等氨基酸具有一定的抗氧化活性［6，14］;且甲硫氨酸易從體內(nèi)流失，需在食物中大量添加［4］。在本實驗中，混合菌發(fā)酵后的豆粕提取液中甲硫氨酸、酪氨酸和組氨酸含量明顯高于未接菌的，因此所制備的植物肽適于作為飼料添加劑。

表1 發(fā)酵產(chǎn)物的氨基酸組成成分含量分析mg/100mLTable 1 Free-amino acid profiles of unfermented and fermented soybean meal mg/100mL

3 結(jié)論

本文以在實際生產(chǎn)中衡量發(fā)酵豆粕品質(zhì)常用的兩個重要參數(shù)(小肽含量和揮發(fā)性鹽基氮含量)為指標，從菌種配比、料水比、接種量、溫度、發(fā)酵周期等5個因素對混合菌固體發(fā)酵制備大豆肽的工藝進行優(yōu)化，確定最佳固體發(fā)酵豆粕的工藝為:植物乳桿菌與枯草芽孢桿菌菌種配比為2∶1、料水比為1∶0.6、接種量為6%、發(fā)酵溫度為30℃、發(fā)酵周期24 h，此條件下，測得小肽含量為10.64%，與未發(fā)酵的對照組(小肽含量:1.82%)相比，小肽含量提高了近10倍;揮發(fā)性鹽基氮含量為50.70 mg/100 g，基本符合植物肽蛋白飼料中對揮發(fā)性鹽基氮含量的要求?；旌暇腆w發(fā)酵豆粕所產(chǎn)小肽的抗氧化能力高達65.76%，該發(fā)酵產(chǎn)物制成飼料后具有清除生物體內(nèi)過量自由基的潛力，可用于預防自由基誘發(fā)的疾病。此外，混合菌發(fā)酵后的產(chǎn)物中必需氨基酸(甲硫氨酸、亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和異亮氨酸)含量高于未接菌的5倍以上，可有效補充動物體內(nèi)的必需氨基酸。綜合以上結(jié)果，該固體發(fā)酵的豆粕將來可開發(fā)為富含小肽的產(chǎn)品，添加到動物飼料中。

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