曾珍，李誠，付剛，楊勇，何利，陳姝娟

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安，625014)

我國的豬骨資源豐富，但是對(duì)豬骨的深加工利用只有1%左右［1］。豬骨中含有豐富的蛋白質(zhì)，從中獲得生物活性肽越來越受到研究者的關(guān)注。例如，有研究人員研究了具有降血脂作用的豬骨膠原肽［2］和提高機(jī)體抗氧化能力的豬骨肽［3］。然而利用豬骨制備免疫活性肽還未見報(bào)道。免疫調(diào)節(jié)活性肽在生物體內(nèi)主要是通過抑制和刺激某些免疫反應(yīng)來達(dá)到預(yù)防和控制疾病的目的［4］，如增強(qiáng)免疫細(xì)胞功能［5］、增強(qiáng)抗體合成和細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)［6］。近年來的研究進(jìn)一步挖掘出了免疫活性肽巨大的潛力，不少研究者將其運(yùn)用到保健醫(yī)療領(lǐng)域。如有研究者分離出具有抗腫瘤功效的免疫活性肽［7］;某些免疫活性肽能夠刺激胰島素釋放，具有治療糖尿病的潛力［8］;某些具有免疫調(diào)節(jié)活性的肽同時(shí)還具有抗炎作用［9］;甚至有研究指出，免疫活性肽因其副作用小，可以成為抗生素的安全替代品［10］。免疫活性肽的來源也很廣泛，可從食物的蛋白質(zhì)里制備出來，如羊胎盤［11］、玉米［12］、小球藻［13］、鱈魚［14］等等。

酶解液是一種混合液，不同分子質(zhì)量的肽組分其生物活性也不同。超濾是以壓力為推動(dòng)力的膜分離技術(shù)之一，采用超濾可以將不同分子質(zhì)量的肽組分分離開來以獲得生物活性最高的肽段。凝膠層析和離子交換層析是被廣泛用于分離生物活性肽的2種分離純化技術(shù)，前者是按被分離物質(zhì)分子質(zhì)量的大小不同進(jìn)行分離，而后者是利用多肽在同一pH值條件下所帶凈電荷的不同從而導(dǎo)致了多肽與離子交換樹脂的親和能力不同這一特點(diǎn)進(jìn)行分離［15］。不少研究者采用凝膠層析及離子交換層析相結(jié)合的方式對(duì)多肽進(jìn)行分離。如趙元暉等人采用先凝膠柱層析而后離子交換層析的方法對(duì)海地瓜水解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，得到了一種新的強(qiáng)活性的ACE抑制肽［16］;劉小紅等人采用先離子交換層析而后凝膠層析的方法對(duì)豬骨降血壓肽進(jìn)行分離純化［17］。

本文選擇豬骨Alcalase堿性蛋白酶酶解液作為潛在的免疫調(diào)節(jié)肽資源，運(yùn)用超濾研究不同分子質(zhì)量肽段的免疫活性，然后采用先凝膠過濾層析而后進(jìn)行離子交換層析的方式進(jìn)行分離，以探索出分離純化豬骨免疫活性肽的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮豬骨(豬后腿股骨頭)市售;昆明種小鼠5周齡，體重18 g，雌性，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)院提供。

Alcalase堿性蛋白酶(11.5×104U/g)，丹麥NOVO公司;SP-Sephadex C-25，Pharmacia公司;Sephadex G-25，Pharmacia公司;其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

BR4i型多功能冷凍離心機(jī)，法國THERMO JOUAN公司;iMark酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，美國伯樂公司;311型CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司;PHS-3C酸度計(jì)，方舟科技公司;POWERDRY PL3000凍干機(jī)，Thermo;DYCZ-24D垂直式電泳儀，北京市六一儀表廠;超濾離心管(膜截留分子質(zhì)量10 ku、5 ku、3 ku、2 ku)，Sartorius。

1.3 方法

1.3.1 分離純化豬骨免疫活性肽的工藝流程

制備酶解液→超濾→凝膠過濾層析→離子交換層析

1.3.2 分離純化豬骨免疫活性肽的操作要點(diǎn)

1.3.2.1 酶解液的制備

參照曾珍的方法［18］制備酶解液:將新鮮豬骨宰碎、蒸煮、干燥之后制成豬骨粉，采用Alcalase堿性蛋白酶酶解豬骨粉，酶解完成后離心過濾取上清液。

1.3.2.2 超濾

將豬骨酶解液通過10 ku的超濾離心管進(jìn)行超濾離心，將分子質(zhì)量低于10 ku的酶解液通過5 ku的超濾離心管進(jìn)行超濾離心，接著將分子質(zhì)量低于5 ku的酶解液用3 ku的超濾離心管進(jìn)行超濾離心，然后將分子質(zhì)量低于3 ku的酶解液用2 ku的超濾離心管進(jìn)行超濾離心。經(jīng)過一系列的超濾離心一共得到5個(gè)組分，分別為分子質(zhì)量＞10 ku(記為組分1)、10 ku＞分子質(zhì)量＞5 ku(記為組分2)、5 ku＞分子質(zhì)量＞3 ku(記為組分3)、3 ku＞分子質(zhì)量＞2 ku(記為組分4)、分子質(zhì)量＜2 ku(記為組分5)，收集這5個(gè)組分進(jìn)行冷凍干燥，將5個(gè)組分配成肽濃度為5 mg/mL的樣品，分別測(cè)定各樣品對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖率，收集小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率最高的組分，備用。

1.3.2.3 凝膠過濾層析

sephadex G-25(細(xì))層析柱(Ф1.6×60)，上樣量為2.5 mL，洗脫液為超純水，進(jìn)樣流速和洗脫流速為1 mL/min，用自動(dòng)部分收集器收集每管2 mL，用紫外檢測(cè)器測(cè)其在214 nm下的OD值，將分離開的組分配制成不同濃度測(cè)定其對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率。

1.3.2.4 透析

在4℃的條件下，將樣品放入透析袋使用磁力攪拌器進(jìn)行透析，每3h更換1次超純水，共更換4次。

1.3.2.5 離子交換層析

填料為 SP-sephadex C-25，上樣量為1 mg/mL，緩沖液為:pH=4.0、0.02 mol/L醋酸鈉緩沖液，0～1.0 mol/L NaCl溶液梯度洗脫，進(jìn)樣流速和洗脫流速為1.0 mL/min，用自動(dòng)部分收集器收集，每管2 mL，用紫外檢測(cè)器測(cè)其在214 nm下的OD值，將分離開的組分配制成不同濃度，測(cè)定其對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖率。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.3.1 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率檢測(cè)方法

(1)無菌小鼠脾淋巴細(xì)胞制備:小鼠禁食12 h，摘眼球放血后脫頸處死，浸泡在75%的乙醇中3～5 min，于超凈工作臺(tái)上無菌打開腹腔，取出小鼠脾臟置于含有無菌Hanks液的平皿中，去除外周結(jié)締組織，并用無菌Hanks液清洗脾臟，去除血液。用無菌注射器芯擠壓研磨，制成細(xì)胞懸液。用Hanks液洗3次，然后1 500 r/min離心8 min，棄去上清液。然后將細(xì)胞懸浮于2 mL的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中。調(diào)整細(xì)胞濃度為 2.0 ×106個(gè)/mL［19-20］。

(2)MTT法測(cè)定脾淋巴細(xì)胞增殖。設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。在96孔板中每孔加入已制備好的小鼠脾細(xì)胞懸液100 μL。對(duì)照組中加入RPMI 1640完全培養(yǎng)液 100 μL，實(shí)驗(yàn)組加入 100 μL 酶解液，置于 37℃下5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68h，再加入 MTT 50 μL，4 h 培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1mL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。室溫下放置15 min后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，以570 nm波長測(cè)定光密度值［21］。

1.3.3.2 肽濃度的測(cè)定

分光光度法(GB 5009.5-2010)。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬骨蛋白酶解產(chǎn)物超濾的分離結(jié)果

超濾分離各組分對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增殖率見表1。由表1可以看出，超濾以后的酶解液對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用大小為組分5＞組分4＞組分3＞組分2＞組分1。研究結(jié)果表明，組分5即分子質(zhì)量低于2 ku的組分脾淋巴細(xì)胞增殖率最高，因此將組分5繼續(xù)進(jìn)行分離純化。

表1 超濾組分的脾細(xì)胞增殖率Table 1 The proliferation rate on spleen cell of ultrafiltration components

2.2 sephadex G-25凝膠過濾結(jié)果

分子質(zhì)量低于2 ku的組分經(jīng)過凝膠層析分離結(jié)果如圖1所示，由圖1可以看出酶解液被分離成4個(gè)組分A1～A4。4個(gè)組分對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增殖活性影響如圖2所示。由圖2可以看到，隨著分離組分作用劑量的增加，脾細(xì)胞增殖率顯著增加，且呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)系，其中A2組分增殖活性最強(qiáng)，且劑量關(guān)系最明顯，當(dāng)濃度在100 μg/mL時(shí)，脾淋巴細(xì)胞的增殖率為109.83%。因此，將峰A2繼續(xù)分離。

圖1 酶解液的凝膠層析sephadex G-25洗脫曲線Fig.1 The gel filtration exchange chromatography of hydrolysates

圖2 凝膠柱層析洗脫組分的脾細(xì)胞增殖活性Fig.2 The proliferation rate on spleen cell of gel filtration chromatography components

2.3 SP-sephadex C-25離子交換結(jié)果

A2經(jīng)SP-sephadex C-25離子交換層析柱分離結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看到，A2被分離成9個(gè)組分B1～B9。9個(gè)組分對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增殖活性影響如圖4所示。由圖4可以看到，不同濃度的分離組分對(duì)脾淋巴細(xì)胞均有一定的增殖能力，其中B4組分增殖活性最強(qiáng)，同時(shí)B4組分劑量關(guān)系最明顯，當(dāng)濃度在100 μg/mL時(shí)，脾淋巴細(xì)胞的增殖率為114.30%。

3 討論與結(jié)論

圖3 A2的離子交換層析SP-sephadex C-25洗脫曲線Fig.3 The ion exchange chromatography of A2

圖4 離子交換層析洗脫組分的脾細(xì)胞增殖活性Fig.4 The proliferation rate on spleen cell of A2 ion chromatography components

一般來說，分子質(zhì)量越低的生物活性肽其生物學(xué)活性越強(qiáng)，這是因?yàn)槎屉牡姆肿淤|(zhì)量越低，其肽段長度越短，空間結(jié)構(gòu)越小，越容易進(jìn)入機(jī)體脾淋巴細(xì)胞內(nèi)部，從而實(shí)現(xiàn)一系列的生物學(xué)功能。He等人將油菜籽蛋白酶解物分離成了不同肽組分:＜1 ku、1～3 ku、3～5 ku、＞5 ku，通過研究不同組分的生物活性發(fā)現(xiàn)，＜3 ku的多肽比＞3 ku的多肽降低了表面的疏水力，從而表現(xiàn)出更高的氧自由基清除能力［22］。張宇昊等人對(duì)花生酶解液進(jìn)行超濾，得到了＜1 ku、1～5 ku、＞5 ku的3種不同分子質(zhì)量范圍的短肽，研究其ACE抑制活性發(fā)現(xiàn)，低于1 ku的花生短肽其ACE抑制活性最強(qiáng)，而＞5 ku的花生短肽其ACE抑制活性最差［23］。王炳祥等人研究了分子質(zhì)量分別為10.139、8.166、7.447、6.761 ku 等4 種山羊胎盤肽的抗氧化活性，結(jié)果表明，分子質(zhì)量為6.761 ku的小肽具有的抗氧化力最強(qiáng)［24］。本實(shí)驗(yàn)中超濾得到的＞10 ku、5～10 ku、3～5 ku、2～3 ku和 ＜2 ku等5組豬骨肽，分子質(zhì)量低于2 ku的小肽增殖活性最強(qiáng)，與上述研究人員的研究結(jié)果一致。目前越來越多的研究人員聯(lián)合使用凝膠過濾層析和離子交換層析對(duì)生物活性肽進(jìn)行色譜分離。本研究中采用先凝膠過濾層析后離子交換層析的方式進(jìn)行分離是考慮到Sephadex G-25具有脫鹽的作用，多肽先脫鹽再經(jīng)SP-Sephadex C-25的分離，而SP-Sephadex C-25的母體Sephadex具有分子篩效應(yīng)，使它在分離物質(zhì)的同時(shí)，具有離子交換作用和分子篩效應(yīng)，從而使分離效果得到了加強(qiáng)。許多研究者也是采用先凝膠過濾層析后離子交換層析的順序進(jìn)行分離純化多肽。LIU等人采用凝膠過濾色譜、離子交換色譜來分離胃蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解水母蛋白中的ACE抑制肽［25］。趙元暉等人采用先Sephadex G-25凝膠柱層析而后SP-Sephadex C-25的方法對(duì)海地瓜水解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，得到了一種新的強(qiáng)活性的ACE抑制肽［26］。張曉麗等人采用先Sephadex G-25凝膠柱層析而后SP-Sephadex C-25對(duì)土鱉蟲復(fù)合多肽進(jìn)行分離純化，得到具有較強(qiáng)溶栓活性的多肽組分［27］。

豬骨免疫活性肽的分離純化方法為:首先對(duì)豬骨蛋白的酶解產(chǎn)物進(jìn)行超濾分離，然后對(duì)分子質(zhì)量低于2 ku的組分進(jìn)行凝膠過濾層析分離，最后對(duì)凝膠層析分離后得到活性最高的組分進(jìn)行離子交換層析分離。當(dāng)最終分離得到的免疫活性肽的質(zhì)量濃度在100μg/mL時(shí)，對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖率為114.30%。

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