楊紅燕，嚴(yán)楠楠，姜艷紅，楊興斌

(陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安，710119)

苦蕎(Fagopyrum tataricum(L.)Gaertn)是1種蓼科蕎麥屬雙子葉植物，又名韃靼蕎麥(tartary buckwheat)，為1年生或多年生宿根性植物［1］。因其喜高寒，多生長(zhǎng)在高寒山區(qū)，在我國(guó)具有悠久的栽培歷史，品種資源豐富，苦蕎現(xiàn)分布在我國(guó)西南和華北等地山區(qū)?？嗍w茶是將苦蕎的種子苦蕎米經(jīng)過篩選、烘烤等工序加工而成的沖飲品。大量的研究資料表明，苦蕎茶在抗氧化、抗衰老、抗癌、增強(qiáng)人體免疫力等方面都具有很好的生理功能［2-4］，因此將其開發(fā)和推廣具有很好的應(yīng)用前景。目前，對(duì)于苦蕎茶的研究大多集中在黃酮類物質(zhì)和蛋白質(zhì)上，對(duì)苦蕎茶多糖的研究鮮見報(bào)道［1，5-7］。而天然的植物多糖具有重要的生物活性，能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫機(jī)能，具有抗腫瘤、降血脂和血糖以及抗病毒等藥理作用［8］。因此，苦蕎茶多糖的研究有著重要的意義，它不僅能夠闡明苦蕎茶多糖的生理活性，而且為苦蕎產(chǎn)品的進(jìn)一步推廣和應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)和指導(dǎo)。本研究采用四川涼山黑苦蕎茶作為對(duì)象，利用水提醇沉方法獲得TBTP，對(duì)其進(jìn)行抗氧化研究，并對(duì)粗多糖進(jìn)行分離純化，用于進(jìn)一步的生理活性研究。

1 試劑與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

黑苦蕎茶，購(gòu)至四川西昌市滋元食品有限公司;超純水，實(shí)驗(yàn)室自制;HCl、NaOH、無(wú)水乙醇、乙醇體積分?jǐn)?shù)(95%)、H2O2、抗壞血酸、FeSO4、Na2HPO4、NaH2PO4、FeCl3、［K3Fe(CN)6］、三氯乙酸(TCA)、水楊酸、三氯甲烷、氮藍(lán)四唑(NBT)、還原型輔酶(NADH)和吩嗪甲硫酸鹽(PMS)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、NaCl，均購(gòu)自天津市天力化學(xué)試劑有限公司，為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

200 g多功能粉碎機(jī)，西安金振機(jī)械設(shè)備有限公司;標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩(60目)，浙江上虞市道墟張興紗篩廠;藥物電子天平SL202N型，上海明橋精密科學(xué)儀器有限公司;HH-6B數(shù)顯恒溫水浴鍋，杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司;LD4-2低速離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;SHBⅢ循環(huán)水多用真空泵，上海比朗儀器有限公司;RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司;透析袋，華美生物工程公司;超純水儀，MILLI-Q MILLIPORE公司;冷凍干燥設(shè)備，EZDRY杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司;微量移液槍，大龍公司;3 cm×50 cm層析柱，上海華美實(shí)驗(yàn)儀器廠;BSZ-100自動(dòng)部分收集器，上海瀘西分析儀器廠有限公司;全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)熱電公司;KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 TBTP的提取及測(cè)定

2.1.1 TBTP 提取工藝流程［9］

苦蕎茶→粉碎→脫脂→熱水提取→離心收集上清液→濃縮水提液→醇沉→除蛋白→透析→冷凍干燥→TBTP

2.1.2 TBTP多糖含量的測(cè)定

TBTP測(cè)定采用改進(jìn)的苯酚-硫酸法［10］。精確稱取干燥至質(zhì)量恒定的葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用蒸餾水定容至100 mL容量瓶，搖勻，稀釋配制質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取1 mL并加入5%苯酚溶液1 mL，再加5 mL濃H2SO4，混合均勻后，室溫放置30 min，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以蒸餾水按照同樣顯色操作為空白，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 TBTP體外抗氧化活性的測(cè)定

2.2.1 對(duì)DPPH·清除能力測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)參照何念武等［11］報(bào)道的方法稍作修改，評(píng)價(jià)TBTP對(duì)DPPH·的清除能力。將3 mL DPPH(1 mmol/L)甲醇溶液與1 mL不同濃度的樣品溶液分別加入試管中，充分混合，黑暗處理30 min，在517 nm處測(cè)定吸光值。VC作陽(yáng)性對(duì)照，用蒸餾水代替多糖溶液作陰性對(duì)照，用甲醇代替DPPH做本底組對(duì)照。清除率按以下方法計(jì)算:

其中:Aa為樣品吸光值，Ab為樣品本底吸光值，A0為陰性對(duì)照值。

2.2.2 ·OH的清除能力測(cè)定

利用Fenton體系法測(cè)定多糖對(duì)·OH的清除能力［12-14］。Fenton 反應(yīng)中 FeSO4與 H2O2反應(yīng)產(chǎn)生·OH。·OH具有較高的反應(yīng)活性，存活時(shí)間短。水楊酸能夠有效捕捉·OH并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm處有強(qiáng)吸收峰。在反應(yīng)體系中加入具有能清除·OH的物質(zhì)，可以減少有色物質(zhì)的生成。故可以通過在510 nm處測(cè)定吸光值的變化來測(cè)定該物質(zhì)的清除·OH的能力，從而判斷其抗氧化能力。往10 mL離心管中依次加入1 mL多糖溶液，1 mL FeSO4(6 mmol/L)溶液，1 mL水楊酸-乙醇(6 mmol/L)溶液和1 mL H2O2(6 mmol/L)溶液，于37℃水浴1 h，然后在510 nm處測(cè)定吸光值。用蒸餾水代替多糖溶液作陰性對(duì)照，用蒸餾水代替H2O2溶液作本底對(duì)照。清除率的計(jì)算:

其中:Aa為樣品吸光值，Ab為樣品本底吸光值，A0為陰性對(duì)照值。

2.2.3 O2-·的清除能力測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)參照 Tian 等［15］、呂喜茹等［16］報(bào)道的方法進(jìn)行，測(cè)定苦蕎多糖對(duì)O2-·的清除能力。在NADHPMS-NBT體系中，NADH與 NBT反應(yīng)產(chǎn)生O2-·，O2-·與PMS結(jié)合生成的化合物顯色并在560 nm處具有最大吸光值?？寡趸芰υ綇?qiáng)，對(duì)O2-·的清除能力就越強(qiáng)，吸光值就越小。往試管中依次加入1 mL NBT(0.078 mol/L)溶液，1 mL NADH(0.468 mol/L)溶液，1 mL不同濃度的多糖溶液，0.4 mL PMS(0.06 mol/L)溶液，充分混勻，靜置5 min，在560nm處測(cè)其吸光值。用蒸餾水代替多糖溶液作陰性對(duì)照，蒸餾水代替PMS作本底組對(duì)照，VC作陽(yáng)性對(duì)照。清除率計(jì)算:

其中:Aa為樣品吸光值，Ab為樣品本底吸光值，A0為陰性對(duì)照值。

2.2.4 TBTP總還原能力的測(cè)定

參照Kirigaya Norimasa［17］提供的方法對(duì)TBTP的總還原能力做評(píng)價(jià)。取1 mL多糖溶液，加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH 6.6)，2.5 mL K3Fe(CN)6溶液(1%)，充分混合，50℃水浴 20 min，然后加入2.5 mL的 TCA(0.1 mg/mL)混勻，3 000 r/min離心10 min，取上清液2 mL，放入另一支試管中，依次加入2 mL蒸餾水和0.5 mL FeCl3(0.1%)，混勻，室溫靜置10 min，然后于700 nm處測(cè)定吸光值。VC作陽(yáng)性對(duì)照，用蒸餾水代替0.1%FeCl3溶液作本底對(duì)照。

2.3 TBTP的分離純化

2.3.1 DEAE-52纖維素預(yù)處理

DEAE-52纖維素為親水弱堿性陰離子交換劑。稱取DEAE-52纖維素樹脂100 g預(yù)處理，在25℃蒸餾水中浸泡24 h，使其充分溶脹。再用雙蒸水反復(fù)洗滌，去除纖維素單體或碎片的懸浮顆粒，抽干，用0.5 mol/L NaOH溶液500 mL浸泡30 min，適當(dāng)攪拌后，用雙蒸水洗至中性;再用0.5 mol/L HCl溶液500 mL浸泡30 min，適當(dāng)攪拌后，用雙蒸水洗至中性;最后用0.5 mol/L NaOH溶液500 mL浸泡30 min，適當(dāng)攪拌后，用雙蒸水洗至中性。抽干，備用。

裝柱與平衡:將預(yù)處理好的DEAE-52纖維素樹脂加適量雙蒸水，攪拌，用超聲脫氣2 h后，沿玻璃棒小心緩慢1次灌到3 cm×50 cm層析柱，同時(shí)輕輕敲擊柱壁，使填料沉降均勻、致密，柱高40 cm，靜態(tài)沉降24 h，使層析柱達(dá)到平衡狀態(tài)，用于粗多糖的分離純化［18］。

2.3.2 TBTP DEAE-52纖維素層析柱純化

稱取TBTP 0.3 g，溶解于10 mL雙蒸水，離心，上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后上樣，用NaCl溶液進(jìn)行梯度預(yù)洗脫，帶刻度的試管收集，每管收集6 mL，收集液隔管用苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)，在484 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以管號(hào)為橫坐標(biāo)，各管吸光值為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，選擇其中洗脫效果明顯的NaCl濃度，在該濃度條件下重復(fù)洗脫，保留尖峰管，分別合并其他各洗脫濃度下的洗脫液，減壓濃縮，透析72 h，冷凍干燥得到粗多糖的初級(jí)分離組分［19］。

2.3.3 TBTP G-150葡聚糖凝膠層析柱純化

葡聚糖凝膠是一種珠狀的凝膠，含有大量的羥基，很容易在水中和電解質(zhì)溶液中溶脹。稱取G-150葡聚糖凝膠25 g，1 000 mL去離子水浸泡2d，使其充分溶脹，傾去上層液，并反復(fù)洗滌，除去懸浮物及其他雜質(zhì)。用抽濾瓶抽氣的方法排氣1 h，以排空凝膠中的空氣。將收集到的DEAE-52柱層析中的峰面積較大的組分用G-150葡聚糖凝膠柱層析進(jìn)一步純化。上樣量為30 mg，上樣體積為5 ml，流速為0.5 mL/min，以去離子水為洗脫劑洗脫，分布收集器進(jìn)行分部收集，6 ml每管，苯酚-硫酸定糖法測(cè)定多糖含量。以試管號(hào)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。保留尖峰管，合并洗脫峰的洗脫液，減壓蒸餾，冷凍干燥。

3 結(jié)果與分析

3.1 TBTP含量測(cè)定

以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)吸光值為縱坐標(biāo)作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。得到其標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 The standard curve of polysaccharide content

由圖1和表1可知，當(dāng)粗多糖濃度0.08 mg/mL時(shí)的吸光度為0.142，代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算得多糖含量為58.75%。

表1 樣品多糖含量測(cè)定Table 1 Determination of samples polysaccharide content

3.2 對(duì)DPPH·清除能力

由圖2可知，TBTP有明顯的清除DPPH·的能力，且表現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)關(guān)系，隨著濃度的增加，清除率越高。在濃度為8 mg/mL時(shí)，TBTP對(duì)DPPH·的清除能力達(dá)到94.16%，與VC的清除能力相當(dāng)，且無(wú)顯著性差異。同時(shí)，當(dāng)多糖的濃度為3 mg/mL時(shí)，板栗多糖的清除率不到40%［20］，而TBTP的清除率已高達(dá)60%。由此可見，作為食源物質(zhì)，TBTP具有明顯的清除DPPH·的能力。

圖2 TBTP對(duì)DPPH·的清除率Fig.2 DPPH radical-scavenging activity of TBTP

3.3 對(duì)·OH的清除能力

圖3 TBTP對(duì)·OH的清除率Fig.3 Hydroxyl radical-scavenging activity of TBTP

由圖3可知，TBTP清除·OH的能力隨著濃度的增大而增強(qiáng)，表現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)關(guān)系，在相同濃度下TBTP對(duì)·OH的清除率低于VC，但在10 mg/mL時(shí)，清除率為83.22%，而在此多糖濃度時(shí)，黃瓜多糖的清除率為 55%［11］，比 TBTP的清除率低28.22%，表明苦蕎茶與其他食源性物質(zhì)相比，其多糖對(duì)·OH很好的清除能力。

3.4 對(duì)O2-·的清除能力

由圖4可知，TBTP能高效的清除O2-·，清除能力隨著濃度的增大而增強(qiáng)，盡管在相同濃度下TBTP對(duì)O2-·的清除率低于VC，但在高濃度時(shí)其清除能力接近于VC。在4 mg/mL時(shí)，TBTP對(duì)O2-·的清除率達(dá)到98.05%，是黃瓜多糖3倍［11］，且與VC無(wú)顯著性差異，表明TBTP對(duì)O2-·有很好的清除能力。

圖4 TBTP對(duì)O2-·的清除率Fig.4 Superoxide radical-scavenging activity of TBTP

3.5 TBTP的總還原能力

由圖5可知，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，TBTP還原力測(cè)試混合液的吸光值隨著濃度的增大而增大，當(dāng)濃度為20 mg/mL時(shí)，TBTP溶液的吸光值達(dá)到0.61，雖與VC具有一定的差距，但可以說明TBTP有一定的總還原能力。

圖5 TBTP的總還原能力Fig.5 Iron(III)to iron(II)reducing power of TBTP

3.6 TBTP的DEAE-52純化結(jié)果

綜合考察以上TBTP體外抗氧化指標(biāo)可知，作為食源性物質(zhì)，TBTP的抗氧化活性相對(duì)偏高，具有廣闊的潛在利用價(jià)值，故將對(duì)其進(jìn)一步的分離純化，明確其組成，為苦蕎的進(jìn)一步推廣和應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)和指導(dǎo)。如圖6所示為TBTP經(jīng)DEAE-52柱層析的結(jié)果。洗脫液分別采用 0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.5 mol/L NaCl溶液梯度洗脫，得到3個(gè)單一峰。0、0.1、0.2、0.5 mol/LNaCl溶液洗脫得到的組分極少，幾乎沒有洗脫峰。其中0.05、0.15、0.3 mol/LNaCl濃度溶液洗脫峰面積最大，為主要洗脫峰。所以僅對(duì)0.05、0.15和0.3 mol/LNaCl洗脫液洗脫所得組分進(jìn)一步純化，做深入研究。收集0.05、0.15、0.3 mol/LNaCl洗脫液洗脫部位，減壓蒸餾，透析(分子截留量10 000 Da)3d，每天換水4次，冷凍干燥，得組分 TBTP-1、TBTP-2、TBTP-3。

圖6 TBTP的DEAE-52柱層析圖Fig.6 Eluting curve of TBTP on DEAE-52 column

3.7 TBTP的G-150葡聚糖凝膠純化結(jié)果

對(duì)TBTP DEAE-52柱層析純化得到較多的組分(TBTP-1、TBTP-2、TBTP-3)進(jìn)行 G-150葡聚糖凝膠層析柱純化，結(jié)果如圖7～圖9所示。

由圖7～圖9可知，DEAE-52柱層析純化后的G-150葡聚糖凝膠柱層析得到的都為均一的峰，說明0.05、0.15和0.3 mol/LNaCl洗脫 DEAE-52纖維素柱層析得到組分為均一多糖，并分別命名為TBTP-1、TBTP-2和 TBTP-3。

圖7 0.05 mol/LNaCl洗脫組份G-150葡聚糖凝膠柱層析圖Fig.7 Elution curve of 0.05 mol/L NaCl eluting component on Sephadex G-150 column

圖8 0.15 mol/LNaCl洗脫組份G-150葡聚糖凝膠柱層析圖Fig.8 Elution curve of 0.15 mol/L NaCl eluting component on Sephadex G-150 column

圖9 0.3 mol/LNaCl洗脫組份G-150葡聚糖凝膠柱層析圖Fig.9 Elution curve of 0.3 mol/L NaCl eluting component on Sephadex G-150 column

4 結(jié)論

(1)水提醇沉法獲得TBTP，通過苯酚-硫酸法測(cè)定苦蕎多糖含量，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得其多糖含量為58.75%。

(2)TBTP對(duì) DPPH·、·OH、O2-·有較好的清除能力，TBTP總還原能力一般。但是隨著多糖溶液濃度的增加，3種自由基的清除能力和還原能力都相應(yīng)增加。在質(zhì)量濃度為8.0 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率為94.16%，對(duì)·OH的清除率為82.25%;在質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時(shí)，對(duì) O2-·的清除率為98.05%。

(3)用纖維素和葡聚糖凝膠分離純化，得到3個(gè)均一多糖分離組分，分別為TBTP-1、TBTP-2、TBTP-3。

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