柯春林，曾曉雄

1(蚌埠學院生物與食品工程系，安徽蚌埠，233030)2(南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇南京，210095)

獸疫鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus)莢膜多糖(capsular polysaccharide)是獸疫鏈球菌在生長代謝過程中分泌到細胞壁外，與細胞壁相結(jié)合的胞外多糖(EPS)。有研究表明，來自鏈球菌的莢膜多糖的主要成分是透明質(zhì)酸(HA)［1］。我們前期的研究結(jié)果也顯示獸疫鏈球菌莢膜多糖的主要成分是HA［2］。然而，至今為止國內(nèi)外沒有關(guān)于獸疫鏈球菌莢膜多糖其他成分的報道。本研究通過對獸疫鏈球菌C55129中國分離株菌株發(fā)酵液的預處理、乙醇沉淀、脫色和脫蛋白獲得了較高糖含量的莢膜多糖，采用DEAE-纖維素柱和Sephadex凝膠柱層析，得到了莢膜多糖組分PCP-I，進行了純度鑒定和分子質(zhì)量測定，并通過紫外(UV)、紅外(IR)、氣相色譜(GC)、液相色譜(HPLC)等手段確定PCP-I的理化特性。據(jù)報道有很多活性氧族自由基(ROS)，如過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子自由基(O2-·)和羥自由基(·OH)等。過多的ROS能毀壞細胞的組分如脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)和DNA［3］。ROS在機體衰老過程中起重要作用。據(jù)報道廣泛存在于植物、動物和微生物體內(nèi)的多糖具有清除自由基并保護機體免受自由基氧化損害的作用［4-6］。有研究顯示鏈球菌莢膜多糖具有抗氧化作用［2，7］，獸疫鏈球菌 C55129 中國分離株菌莢膜多糖組分是否具有抗氧化活性，本文也采用了不同的體外抗氧化實驗研究了莢膜多糖純化組分PCP-I的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

獸疫鏈球菌C55129菌株，購自中國獸藥監(jiān)察所;腦心浸液(BHI，DIFCO，USA)，無菌綿羊全血，杭州新銳生物工程有限公司;L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、L-巖藻糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-葡萄糖醛酸，Sigma;DEAE-52、Sephadex G-100，Whatman;多糖標準品 P-82，Japan;吡啶、鹽酸羥胺、醋酸酐、肌醇、碘甲烷，均為色譜純;咔唑、四硼砂鈉，三氯乙酸、三氟乙酸、苯酚、濃 H2SO4、無水乙醇、FeCl3、Fe-SO4、Na2H2PO4、NaH2PO4、鐵氰化鉀、H2O2、FeCl2，均為國產(chǎn)分析純;考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白等，均為國產(chǎn)分析純;1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH)、硝基四氮唑藍(NBT)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和菲洛嗪(ferrozine)，購自 Sigma公司。

1.1.2 實驗儀器

高壓滅菌鍋(LDZX-40BI型)，上海申安醫(yī)療器械廠;超凈工作臺(SW-CJ-IBU型)，蘇凈集團安泰公司;隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GRP-9080型)，上海森信實驗儀器有限公司;恒溫調(diào)速搖床柜(HYG-II型)，上海新星自動化控制設(shè)備成套廠;電熱鼓風干燥箱(DHG-9030A型)，上海一恒科技有限公司;低速離心機(Anke TDL-5型)，上海安亭科學儀器廠;高速臺式離心機(MIKRO-2型)，HITTACH;紫外-可見分光光度計(UV-2450型)，Shimadzu，日本;可見分光光度計(722S型)，上海菁華科技儀器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4型)，江蘇國華電器有限公司;層析柱(2.6×30 cm，2.6×70 cm)，上海亞榮生化儀器有限公司;HL-2B數(shù)顯恒流、BS-100A自動分布收集器，上海滬西分析儀器廠;循環(huán)水式多用真空泵(SHB-IIIA型)，鄭州長城科工貿(mào)有限公司;真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Laborota 4000型)，Heidolph，德國;冷凍干燥機(Alpha 1-2型)，LABCONCO，英國;AY-120電子精密天平、BL-220H分析天平，Shimadzu，日本;紅外光譜儀(MB 154S型)，Bomen，加拿大;Agilent 1100 高效液相色譜儀、Agilent 6890N氣相色譜儀，美國安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 PCP-I的制備、分離和純化

(1)莢膜多糖粗多糖的制備 菌種在5%綿羊BHI血平板37℃培養(yǎng)24 h→種子液37℃培養(yǎng)24 h→發(fā)酵培養(yǎng)24 h(裝液量為50 mL/500 mL，接種量為5%，37℃，200 r/min)→發(fā)酵液。接著用三氯乙酸法殺菌、除菌。再采用CTAB季氨鹽絡(luò)合和乙醇沉淀法提取莢膜多糖粗多糖(CCP)，HP-20聚苯乙烯型大孔吸附樹脂脫色，Sevag法［8］脫蛋白。

(2)PCP-I的分離和純化 先采用DEAE-52(2.6×30 cm)纖維素離子交換柱層析。上樣時，取脫色和脫蛋白后的CCP液6 mL(濃度為10 mg/mL)。分別采用雙重純蒸水(dH2O)(1～20管)、0.1 mol/mL NaCl(21～40管)和0.5 mol/mL NaCl(41～60管)進行梯度洗脫，流速0.8 mL/min，10 mL/管收集，用咔唑法［9］每隔一管測定酸性糖和硫酸苯酚法［10］測定中性總糖的含量。然后采用Sephadex G-100(2.6 cm×70 cm)凝膠柱層析。上樣時，取DEAE-52層析純化后的PCP-I純莢膜多糖液2 mL(濃度為10 mg/mL)。均用雙重純蒸水蠕動泵洗脫，流速均為0.5 mL/min，6 mL/管自動收集儀收集，洗脫至苯酚-硫酸法無糖檢測出為止。用硫酸苯酚法［10］每隔一管測定中性總糖的含量，多糖純度用HPLC檢測。純化多糖得率計算公式:

1.2.2 理化性質(zhì)分析

(1)總糖含量的測定 采用苯酚-硫酸法測定莢膜多糖總糖的含量［10］;(2)酸性糖的測定(GlcA含量的測定)咔唑法［9］;(3)蛋白質(zhì)含量的測定-考馬斯亮藍法［11］;(4)分子質(zhì)量的測定(黏度法)用一點法［12］測定莢膜多糖的特性黏度，根據(jù)經(jīng)驗公式η=3.6×10-4Mr0.78計算莢膜多糖的分子質(zhì)量(Mr)。

1.2.3 PCP-I的分子質(zhì)量及光譜學分析

(1)莢膜多糖組分純度鑒定和分子質(zhì)量測定本文采用高效凝膠過濾色譜法(HPGFC)鑒定莢膜多糖組分PCP-I的純度，同時測定其分子質(zhì)量。以普魯蘭多糖(P-200，P-100，P-20，P-10和 P-5)平均分子質(zhì)量的對數(shù)(lgMw)對保留時間(tR)作圖，得標準曲線。HPGFC檢測條件為:色譜柱，TSK-Gel G3000 SW;流動相，含0.1 mol/L Na2SO4的10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8);流速，1 mL/min;進樣體積，20 μL;檢測器，示差折光檢測器;柱溫，25℃;檢測器溫度，25℃。精確稱取樣品PCP-I配成1 mg/mL溶液，在同樣條件下進行柱層析，記錄樣品的tR值，對照標準曲線，根據(jù)回歸方程計算樣品的分子質(zhì)量。

(2)紫外光譜分析利用待測樣品在280 nm處有無吸收峰來檢測樣品中是否含有蛋白質(zhì)和在260 nm處有無吸收峰來判斷是否含有核酸;在206 nm處有無吸收峰來判斷是否含有多糖。將多糖樣品PCP-I配成0.5 mg/mL的溶液，用紫外分光光度計在波長200～400 nm范圍內(nèi)進行紫外掃描。

(3)紅外光譜分析 取干燥的PCP-I 1.0 mg，用KBr壓片，在4 000～400 cm-1的范圍內(nèi)進行紅外光譜掃描，記錄紅外光譜圖。

1.2.4 PCP-I單糖組成分析

采用完全酸水解法來測定多糖組分PCP-I的單糖組成。多糖樣品10 mg溶于2 mL 2 mol/L的三氟乙酸(TFA)，置安瓶中封口，120℃水解2 h。水解液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入5 mL甲醇，蒸干，重復多次，去除TFA后加少量水溶，凍干，得完全酸水解單糖樣品。采用糖睛乙酸酯法［10］對單糖樣品進行衍生，取水解干燥后的單糖樣品5 mg，加10 mg鹽酸羥胺和3 mg肌醇，0.5 mL吡啶，封口，90℃下加熱反應30 min，間或振蕩。取出后冷至室溫，加入0.5 mL醋酸酐，90℃下繼續(xù)反應30 min后得糖睛乙酸酯衍生物。5 000 r/min離心10 min，取上清(若有沉淀，加丙酮溶解或稀釋，再離心取上清)。以肌醇六乙酸酯為內(nèi)標，衍生物直接進行氣相色譜分析。色譜柱:彈性石英毛細管柱 HP-5，30.0 m ×320 μm ×0.25 μm;柱溫210℃;進樣口溫度250℃;氫火焰離子化檢測器(FID);檢測器溫度:250℃;載氣:N2。程序升溫為柱初溫120℃，以3℃/min至210℃，保持4 min。根據(jù)出峰時間和峰面積比可知樣品的單糖組成和摩爾比。計算公式:

其中，Wx為樣品中單糖質(zhì)量，mg;Wi為樣品中加入內(nèi)標的質(zhì)量，mg;Ax為樣品中單糖的峰面積;Ai為樣品中內(nèi)標的峰面積;校正因子K=Wi×As/(Ws×Ai)。

1.2.5 PCP-I的體外抗氧化活性測定

(1)還原力的測定 根據(jù)文獻［13］的報道，稍做修改。取不同濃度樣品溶液1.0 mL于試管中，分別加入1.0 mL磷酸鹽緩沖液和1.0 mL K3Fe(CN)6溶液，混勻，50℃水浴20 min，取出后迅速冷卻，再加1.0 mL三氯乙酸，混勻，再加0.2 mL FeCl3溶液，混勻，10 min后測A700nm。同時做樣品空白實驗(以水代替FeCl3溶液)。以吸光度值(A1-A2)表示樣品的還原力。A1為樣品實驗的吸光值;A2為樣品空白實驗的吸光值。

(2)螯合金屬離子的能力 根據(jù)Liu等［14］的方法，稍做修改。取不同濃度樣品溶液1.0 mL于試管中，分別加入0.05 mL FeCl2溶液、0.2 mL菲洛嗪(ferrozine)溶液和2.75 mL水，混勻，10 min后測A562nm。同時做樣品空白實驗(以水代替FeCl2溶液)。以水代替樣液和FeCl2溶液，做參比實驗調(diào)零用。

其中:A0-水代替樣液時的吸光值;A1-樣品實驗的吸光值;A2-樣品空白實驗的吸光值。

(3)對DPPH·的清除作用 采用Ke等［15］的方法，取不同濃度樣品溶液1.0 mL于試管中，加入0.2 mL配制的DPPH溶液，再加入2.0 mL水，混合均勻，反應30 min后于A517nm處測其吸光值。同時做樣品空白實驗(以水代替DPPH溶液)。以水代替樣液和DPPH溶液，做參比實驗調(diào)零用。

其中:A0-水代替樣液時的吸光值;A1-樣品實驗的吸光值;A2-樣品空白實驗的吸光值。

(4)對超氧陰離子自由基(O2-·)的清除作用根據(jù)文獻［16］的報道，稍做修改。取不同濃度樣品溶液1.0 mL于試管中，分別加入1.0 mL NBT、1.0 mL NADH和1.0 mL PMS，混勻起始反應，于25℃水浴5 min，測A560nm。同時做樣品空白實驗(以磷酸鹽緩沖液代替NBT)。

其中:A0-水代替樣液時的吸光值;A1-樣品實驗的吸光值;A2-樣品空白實驗的吸光值。

(5)對羥自由基(·OH)的清除作用根據(jù)Zhang等［17］的報道，稍做修改。采用Fenton反應研究多糖對·OH的清除能力。在反應體系中分別加入1 mL鄰二氮菲，1.5 mL PBS緩沖液，充分混勻后，加入1.0 mL FeSO4溶液，立即混勻，再向反應體系中加入不同濃度的多糖溶液1 mL，混勻。同時設(shè)陰性對照管和正常管，不加糖液。再分別加入1 mL H2O2溶液，正常管不加H2O2溶液，以等體積蒸餾水補充體積。在37℃水浴中反應30 min，測定A536nm，做3次平行實驗。

其中，A0-正常管吸光值;A1-陰性對照管吸光值;A2-樣品管吸光值。

(6)對脂質(zhì)過氧化抑制作用 參考文獻［18］的報道，稍有調(diào)整。取0.5 mL卵磷脂乳濁液，加入1 mL不同濃度的多糖溶液，100 μL的FeSO4溶液，1.5 mL的蒸餾水。正常管和對照管不加多糖液，其他試劑同前。將上述試管37℃下水浴2 h，取出后，加入1.5 mL乙酸溶液，100 μL TCA，靜置10min后，加入1.5 mL 0.8%的TBA和1.1%的SDS的混合液(體積比1∶1)，正常管不加 TBA，于95℃下反應15min，冰水冷卻后，10 000 g離心5 min，取上清液，測A532nm，做3次平行實驗。

其中，A0-正常管吸光值;A1-陰性對照管吸光值;A2-樣品管吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCP-I的分離和純化

CCP經(jīng)離子交換層柱洗脫出多個組分，其中蒸餾水洗脫出的中性糖組分如圖1A所示。F1組分經(jīng)凝膠柱層析均只洗脫出單一的峰，即均一組分PCP-I，如圖1B所示。

2.2 PCP-I的理化性質(zhì)

PCP-I為白色粉末，顏色較淺，可溶于水并形成黏性溶液。PCP-I得率、糖醛酸含量、蛋白含量、特性黏度和分子質(zhì)量(表1)。PCP-I不含糖醛酸，為中性糖。

表1 PCP-I的得率及初步鑒定Table 1 Yield and preliminary characterization of PCP-I

2.3 PCP-I的分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)特性

圖1 CCP的DEAE-52和G-100層析洗脫曲線Fig.1 Elution curve of CCP by DEAE Cellulose-52 anion-exchange chromatography and by Sephadex G-100 column chromatography

(1)分子質(zhì)量 HPGFC色譜圖如圖 2所示。PCP-I組分在色譜柱上顯示為峰形對稱的單峰，證明這兩個多糖樣品分子質(zhì)量分布均一，純度較高。PCP-I的保留時間(tR)為9.927 min，根據(jù)多糖標準品分子質(zhì)量的標準曲線，計算出莢膜多糖的平均分子質(zhì)量(Mw)。PCP-I為0.029 2×103kDa，與黏度法推算出的分子質(zhì)量相差不大。

圖2 PCP-I的HPGFC洗脫圖譜Fig.2 Elution pattern of PCP-I on HPGFC

(2)紫外和紅外光譜分析 PCP-I的紫外掃描圖譜分別如圖3A所示。由圖3 A可知莢膜多糖PCP-I在206 nm處有多糖的特征吸收峰，260 nm、280 nm附近曲線平坦，幾無核酸和蛋白質(zhì)的吸收峰，說明PCP-I幾乎不含核酸和蛋白質(zhì)成分。紅外掃描圖譜如圖3B所示，PCP-I具有多糖特征。PCP-I的吸收譜帶在3 409.51 cm-1處有一強且寬的吸收峰，系多糖上的O-H形成分子間、內(nèi)氫鍵;2 940.55 cm-1附近的肩峰為飽和C-H伸縮振動的信號;814.912 cm-1處有吸收峰，表明PCP-I可能含有甘露吡喃糖［10］。

圖3 A PCP-I的紫外掃描圖譜和紅外光譜圖Fig.3 UV spectrum and FT-IR spectrum of PCP-I

圖4 標準單糖衍生物和PCP-I衍生物的氣相色譜圖Fig.4 GC spectra of derivatives from standard monosaccharides and monosaccharide compositions of PCP-I

(3)單糖組成分析 7種單糖標準品GC圖如圖4A所示。從左到右分別為:1，L-鼠李糖(tR，18.157);2，L-阿拉伯糖(tR，18.722);3，L-巖藻糖(tR，19.064);4，D-木糖(tR，19.245);5，D-甘露糖(tR，25.933);6，D-葡萄糖(tR，26.287);7，D-半乳糖(tR，27.000);8，肌醇(tR，30.352)。PCP-I 完全酸水解GC圖如圖4B所示。從左到右分別為:2，阿拉伯糖(tR，18.640);5，甘露糖(tR，25.968);6，葡萄糖(tR，26.271);7，半乳糖(tR，26.937);8，肌醇(tR，30.293)。PCP-I單糖組成及摩爾比為阿拉伯糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖 =0.99∶27.03∶11.84∶1.00。

2.4 PCP-I體外抗氧化活性

(1)還原力。多糖具有抗氧化能力，能阻止鏈的發(fā)生，結(jié)合過渡金屬離子，解聚過氧化物，防止氫的奪取反應以及自由基的清除［19］。其中多糖的還原力是其潛在抗氧化能力的一個重要的衡量指標［20］。如圖5A所示，當莢膜多糖的質(zhì)量濃度在75～1 200 μg/mL時，其還原力具有劑量依賴關(guān)系。莢膜多糖的還原力隨著樣品濃度的增大而增長，在1 200 μg/mL時達到最大，PCP-I的還原力(ΔA700nm)為0.615，說明莢膜多糖具有較好的還原力作用，而且PCP-I的作用很明顯。

(2)螯合金屬離子的能力。有機類生物大分子螯合金屬離子的能力是其抗氧化活性的一種表現(xiàn)［21］。圖5B 顯示，在 78 ～1 250 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，PCP-I螯合Fe2+的能力逐漸增大。在1 250 μg/mL時，PCP-I螯合金屬離子的能力達到 84.62%。由此可見PCP-I有較好的螯合Fe2+的能力。

(3)對DPPH·的清除作用。DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基，是估測抗氧化劑清除自由基活性的有力工具［22］。在所有的測試濃度范圍內(nèi)，莢膜多糖清除DPPH·活性很明顯，如圖5C所示。隨著多糖樣品濃度的增加，其清除能力增長顯著(P＜0.01)，在1 600 μg/mL質(zhì)量濃度時，PCP-I清除 DPPH·活性達到45.57%。

圖5 莢膜多糖PCP-I的抗氧化活性Fig.5 The antioxidant activity of capsule polysaccharides PCP-I

(4)對超氧陰離子自由基(O2-·)的清除作用。O2-·是那些具有和生物大分子反應引起組織毀壞自由基的前體［23］。O2-·在活性氧族自由基(ROS)的形成中起很重要作用，這些 ROS如過氧化氫(H2O2)、羥自由基(·OH)和單線態(tài)氧(1O2)。過多的ROS能毀壞細胞的組分如脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)和DNA［24］。如圖5D所示，莢膜多糖對 O2-·的清除活性隨著多糖濃度的增加而增長，在1 250 μg/mL濃度時，PCP-I清除O2-·活性達到40.84%。由此可見莢膜多糖具有較好的清除O2-·的能力，其機制可能是莢膜多糖被O2-·降解［25］。盡管O2-·本身不能降解莢膜多糖，但它能參與過渡金屬離子的離子反應并產(chǎn)生氧化性很強的·OH，·OH能降解莢膜多糖。

(5)對羥自由基(·OH)的清除作用?！H和其衍生化自由基是破壞性最強的ROS，它的主要作用是引起生物大分子的氧化損傷。圖5E顯示了莢膜多糖清除·OH的情況。在69～1 120 μg/mL濃度范圍內(nèi)，CCP清除·OH的活性隨多糖濃度的增加而增大。在 1 120 μg/mL濃度時，PCP-I清除·OH的活性達到40.94%。說明莢膜多糖PCP-I具有適度的清除·OH的能力。莢膜多糖或許是通過自身的降解［26］來發(fā)揮其抗氧化作用的。

(6)對脂質(zhì)過氧化抑制作用。脂質(zhì)過氧化是自由基介導的鏈反應的自然結(jié)果，該反應的終端產(chǎn)物如過氧化氫脂質(zhì)和具有未配對電子或能從其他分子中吸附電子的變化種類。所有的這些終端產(chǎn)物能直接或間接地破壞DNA分子［27］。PCP-I對非酶的脂質(zhì)過氧化的作用結(jié)果如圖5F所示，在1 120 μg/mL質(zhì)量濃度時，PCP-I對脂質(zhì)過氧化的抑制作用為 81.17%。由此可見莢膜多糖具有很高的脂質(zhì)過氧化抑制作用，其機制可能是多糖和膜的相互作用的結(jié)果［28］。

3 結(jié)論

從獸疫鏈球菌C55129菌株發(fā)酵液中提取到莢膜多糖粗品(CCP)，通過DEAE-52纖維素陰離子交換柱層析和Sephadex G-100凝膠柱層析從CCP中分離到中性糖組分，命名為 PCP-I，得率為5.989%，PCP-I為白色固體，易溶于水，分子質(zhì)量為0.029 2×103kDa。.利用氣相色譜法分析單糖組成及摩爾比為阿拉伯糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=0.99∶27.03∶11.84∶1.00。體外抗氧化實驗結(jié)果表明，PCP-I有較強的螯合金屬離子的能力、還原力和抑制脂質(zhì)過氧化作用，以及清除DPPH·、O2-·和·OH活性的能力。

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