柯智健，孫磊，曹麗，常歡歡，劉曉燕

1(淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江蘇淮安，223300)

2(淮陰師范學(xué)院江蘇省生物質(zhì)能源與酶技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇淮安，223300)

檸檬酸是一種重要的有機(jī)酸，被廣泛應(yīng)用于食品業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥業(yè)等眾多領(lǐng)域，其生產(chǎn)開發(fā)存在著廣闊的拓展空間［1］。目前檸檬酸工業(yè)生產(chǎn)主要通過黑曲霉(Aspergillus niger)利用淀粉質(zhì)糧食原料發(fā)酵獲得。近年來，糧食發(fā)生世界性短缺而價(jià)格飛漲，我國的檸檬酸低成本生產(chǎn)優(yōu)勢在不斷減小;同時(shí)，檸檬酸傳統(tǒng)工業(yè)生產(chǎn)菌株黑曲霉也因其致病性而受到人們的質(zhì)疑，因此，尋找低價(jià)的生產(chǎn)原料和安全的生產(chǎn)菌株成為檸檬酸發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的當(dāng)務(wù)之急［2］。

隨著世界能源危機(jī)愈演愈烈，化石燃料的替代能源——可再生生物柴油的研究炙手可熱。生物柴油的生產(chǎn)幾乎可以采用所有的天然油脂為原料，包括微生物產(chǎn)生的油脂。產(chǎn)油微生物能在農(nóng)副產(chǎn)品及食品工業(yè)產(chǎn)生的廢棄物中生長并生產(chǎn)胞內(nèi)油脂，可緩解動(dòng)植物油脂作為生物柴油原料的緊缺局面，從而有效降低生物柴油的生產(chǎn)成本，因此微生物胞內(nèi)油脂的開發(fā)利用已成為研究的熱點(diǎn)［3］。

近年來，解脂耶羅維亞酵母菌(Yarrowia lipolytica)因較高的發(fā)酵檸檬酸產(chǎn)量而受到研究者的普遍關(guān)注。Y.lipolytica是一種常見的好氧菌，對人類健康無任何危害，該菌在氧氣充足和碳源過剩的情況下，可產(chǎn)生大量的檸檬酸［4］，是檸檬酸發(fā)酵工業(yè)中獨(dú)具潛力的A.niger替代菌株。Y.lipolytica能夠在油脂為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長并生產(chǎn)相關(guān)產(chǎn)物［5-7］，除了高產(chǎn)檸檬酸外，Y.lipolytica還是一種重要的微生物油脂生產(chǎn)菌株，該菌經(jīng)過改造后以油脂為原料其胞內(nèi)油脂累積量可達(dá)到61.7%［8］。

地溝油是從餐飲業(yè)廢水中提取的不可再食用油脂，含多種有害成分，有很強(qiáng)的致癌性［9］。然而由于價(jià)格低廉，地溝油回流至餐飲業(yè)的不法現(xiàn)象屢禁不止，給社會(huì)帶來巨大危害。地溝油屬于混合油脂，可作為Y.lipolytica生產(chǎn)檸檬酸和胞內(nèi)油脂的碳源，而地溝油中的有害成分可在檸檬酸和胞內(nèi)油脂發(fā)酵及提純過程中去除［2］?；诖耍狙芯恳訷.lipolytica為發(fā)酵菌株，以廉價(jià)地溝油為生產(chǎn)原料，通過條件優(yōu)化及發(fā)酵控制，實(shí)現(xiàn)檸檬酸及胞內(nèi)油脂的同時(shí)發(fā)酵生產(chǎn)，為降低兩種產(chǎn)物的發(fā)酵成本，實(shí)現(xiàn)地溝油的合理利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本研究所用的菌株為解脂耶羅維亞酵母菌(Yarrowia lipolytica SWJ-1b)，該菌分離自渤海魚類腸道。

1.1.2 原料

實(shí)驗(yàn)所用地溝油收集自當(dāng)?shù)貜U棄油脂回收站。

1.1.3 培養(yǎng)基

YPD(yeast extract peptone dextrose medium)固體培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 20.0，蛋白胨 20.0，酵母粉10.0，瓊脂粉 20.0。

YPD液體培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 20.0，蛋白胨20.0，酵母粉 10.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):地溝油或甘油，(NH4)2SO40.2，KH2PO42.0，Na2HPO410.0，MgSO4·7H2O 1.5，CaCl20.2，ZnSO4·7H2O 0.02，MnSO4·H2O 0.06，酵母提取物 0.3，硫胺素 0.006，用濃 HCl調(diào)pH至6.0，在115℃下滅菌30 min，冷卻后加入過濾除菌的1.6%(w/v)溴甲酚紫指示劑［3］。

1.2 方法

1.2.1 種子液的培養(yǎng)

Y.lipolytica SWJ-1b菌株在YPD固體培養(yǎng)基上活化后，挑取單菌落接種于 YPD液體培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)至菌體濃度達(dá)到OD600=30.0。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)

上述菌液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃下振蕩培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)基中指示劑顏色變化用2.0 mol/L KOH調(diào)節(jié)pH，使之保持在6.0左右，直至指示劑顏色不再變化，說明發(fā)酵結(jié)束［4］。

1.2.3 菌體顯微形態(tài)觀察

發(fā)酵結(jié)束時(shí)，直接取樣在相差顯微鏡下觀察拍照，放大倍數(shù)為40×10。

1.2.4 發(fā)酵液中檸檬酸含量測定

利用高效液相色譜分析法測定發(fā)酵液中的檸檬酸含量。色譜及檢測條件為:色譜柱類型:Agilent Zorbax NH2column(5.0 μm，4.6 mm ×250.0 mm);流動(dòng)相:10.0 mmol/L(NH4)2HPO4溶液(pH 2.7);流速:0.5 mL/min;進(jìn)樣量:20.0 μL;溫度:25 ℃;紫外檢測波長:210 nm。

1.2.5 菌體油脂含量測定及提取

發(fā)酵液在5 000 r/min下離心5 min，去除上清，所得菌體用正己烷離心洗滌2～3次去除細(xì)胞表面油脂，放入80℃烘箱烘至恒重，稱量細(xì)胞干重。將烘至恒重的菌體在研缽中研磨后，利用索氏提取法提取胞內(nèi)油脂，并計(jì)算菌體油脂含量［10］。

1.2.6 油脂成分分析［8］

上述步驟所得油脂利用Agilent 6890氣相色譜儀分析其成分。色譜柱:JH-FFAP石英毛細(xì)管柱(50m ×0.32 mm ×0.25 μm);柱溫:程序升溫，80℃—150℃(5℃/min，停留5 min)—250℃(3℃/min);FID檢測溫度:280℃;進(jìn)樣口溫度:260℃;載氣:99.999%氮?dú)?載氣流速:1.2 mL/min;分流比:1∶50;進(jìn)樣量:1 μL。

1.2.7 培養(yǎng)基中地溝油含量測定

發(fā)酵過程中發(fā)酵培養(yǎng)基的油脂含量測定參照ZHAN 的方法［11］。

1.2.8 發(fā)酵條件對產(chǎn)物產(chǎn)量的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基的地溝油初始濃度為40.0 g/L，分別以 104、105、106、107、108、109、1010個(gè)細(xì)胞/L 培養(yǎng)基的發(fā)酵液菌體濃度進(jìn)行接種，考察接種量對產(chǎn)物產(chǎn)量的影響;發(fā)酵培養(yǎng)基的地溝油初始濃度分別為30.0，40.0，50.0，60.0，70.0，80.0，90.0 g/L，考察碳源初始濃度對產(chǎn)物產(chǎn)量的影響;在地溝油初始濃度為80.0 g/L，接種量為5×108個(gè)細(xì)胞/L培養(yǎng)基的情況下，分別以 100、120、140、160、180、200、220 r/min 的搖床轉(zhuǎn)速進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，考察培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對產(chǎn)物產(chǎn)量的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 Y.lipolytica SWJ-1b分別以甘油和地溝油為碳源的發(fā)酵情況比較

甘油是Y.lipolytica SWJ-1b發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸較好的原料之一［2，4］，我們將 Y.lipolytica SWJ-1b 分別在以甘油和地溝油為碳源(濃度40.0 g/L)的發(fā)酵情況進(jìn)行了比較。圖1a和圖1b分別是Y.lipolytica SWJ-1b在甘油和地溝油發(fā)酵培養(yǎng)基中的細(xì)胞形態(tài)的顯微照片，其中，圖1b中的酵母細(xì)胞內(nèi)存在明顯的油滴，初步證明Y.lipolytica SWJ-1b以地溝油為原料時(shí)有大量胞內(nèi)油脂的累積。圖2數(shù)據(jù)顯示，以地溝油為碳源時(shí)的檸檬酸產(chǎn)量(21.8 g/L)略低于以甘油為碳源的檸檬酸產(chǎn)量(23.1 g/L)，但胞內(nèi)油脂的含量(32.3 g/100 g細(xì)胞干重)卻明顯高于后者(15.6 g/100 g細(xì)胞干重)，這說明地溝油可以作為Y.lipolytica SWJ-1b同時(shí)產(chǎn)檸檬酸和胞內(nèi)油脂的原料。

圖1 Y.lipolytica SWJ-1b分別在甘油和地溝油發(fā)酵培養(yǎng)基中的細(xì)胞形態(tài)(放大倍數(shù)10×40)Fig.1 The cell morphology of Y.lipolytica SWJ-1b in the medium containing glycerol and illegal cooking oil respectively(Magnification 10×40)

圖2 Y.lipolytica SWJ-1b分別以甘油和地溝油為碳源的產(chǎn)物產(chǎn)量Fig.2 Products yields of Y.lipolytica SWJ-1b from illegal cooking oil and glycerol respectively

2.2 菌株接種量對產(chǎn)物產(chǎn)量的影響

發(fā)酵過程是微生物細(xì)胞參與的生物化學(xué)反應(yīng)過程，產(chǎn)物的生物合成受微生物細(xì)胞的數(shù)量及代謝情況的影響。一般情況下，菌體濃度越高，產(chǎn)物產(chǎn)量也高;但是菌體濃度過高，過量的菌體則會(huì)呼吸消耗碳源及營養(yǎng)物質(zhì)，引起培養(yǎng)基溶氧不足，反而降低產(chǎn)物產(chǎn)量［12］，因此需確定發(fā)酵的最佳接種量。由圖3可知，隨著接種量的增加，檸檬酸和油脂產(chǎn)量提高，當(dāng)接種量分別為108及109個(gè)細(xì)胞/L培養(yǎng)基時(shí)，檸檬酸和油脂產(chǎn)量分別達(dá)到最高(22.1 g/L，33.6 g/100 g細(xì)胞干重)，之后隨著接種量進(jìn)一步提高，檸檬酸及油脂產(chǎn)量下降。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們采用的接種量為5×108個(gè)細(xì)胞/L培養(yǎng)基。

圖3 接種量對產(chǎn)物產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of inoculation size on the yields of products

2.3 地溝油含量對產(chǎn)物產(chǎn)量的影響

Y.lipolytica產(chǎn)檸檬酸及胞內(nèi)油脂的先決條件是培養(yǎng)基碳源過剩，因此碳源濃度對這2種產(chǎn)物的產(chǎn)量有重要影響。理論上產(chǎn)物產(chǎn)量應(yīng)隨碳源濃度提高而增高，而事實(shí)往往并非如此。在我們之前的研究中，Y.lipolytica 87利用菊粉產(chǎn)檸檬酸時(shí)，菊粉的最佳初始濃度為100.0 g/L，培養(yǎng)基菊粉初始濃度過高或過低所得的檸檬酸產(chǎn)量均不理想［13］;而在Anita等的研究中，Y.lipolytica Wratislavia AWG7利用甘油發(fā)酵檸檬酸的最適濃度為50.0 g/L，碳源濃度進(jìn)一步提高則檸檬酸產(chǎn)量有所下降［14］，由此可見培養(yǎng)基碳源濃度對產(chǎn)物產(chǎn)量有直接影響。由圖4可知，當(dāng)培養(yǎng)基中碳源濃度較低時(shí)，檸檬酸及油脂產(chǎn)量均隨碳源濃度提高而提高，碳源濃度增至80.0 g/L時(shí)，檸檬酸及油脂產(chǎn)量均達(dá)最高值(33.5 g/L，43.8 g/100 g細(xì)胞干重)，之后隨培養(yǎng)基中地溝油濃度進(jìn)一步提高，二者產(chǎn)量均出現(xiàn)下降趨勢，這說明80.0 g/L是Y.lipolytica利用地溝油同時(shí)生產(chǎn)檸檬酸及油脂的最佳初始碳源濃度。

圖4 地溝油含量對產(chǎn)物產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of the initial concentrations of illegal cooking oil on the yields of products

2.4 培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對產(chǎn)物產(chǎn)量的影響

微生物合成油脂及檸檬酸都是需氧的過程，因此供氧量對這2種產(chǎn)物的產(chǎn)量都有很大影響。其中，產(chǎn)油真菌在供氧缺乏條件下，甘油三酯合成會(huì)強(qiáng)烈受阻，并大量積累磷脂和游離脂肪酸;而產(chǎn)檸檬酸菌株在氧氣不足時(shí)，碳源則主要通過糖酵解途徑消耗，而很少進(jìn)入TCA循環(huán)進(jìn)而生成檸檬酸。本部分實(shí)驗(yàn)通過控制培養(yǎng)過程的搖床轉(zhuǎn)速來控制發(fā)酵過程中的供氧量，在圖5中，隨搖床轉(zhuǎn)速增加，產(chǎn)物產(chǎn)量增加，當(dāng)轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)，檸檬酸及胞內(nèi)油脂產(chǎn)量均達(dá)到最高，而菌體生物量則隨轉(zhuǎn)速的提高而降低。

圖5 搖床轉(zhuǎn)速對產(chǎn)物產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of rotate speeds of shaker on the yields of products

2.5 發(fā)酵過程產(chǎn)物含量變化趨勢

在培養(yǎng)基地溝油濃度為80.0 g/L，接種量為5×108個(gè)細(xì)胞/L培養(yǎng)基及培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分鐘的培養(yǎng)條件下，檸檬酸及油脂產(chǎn)量變化趨勢如圖6所示。從圖6可以看出，在發(fā)酵的前72 h主要為菌體生長階段，此時(shí)檸檬酸及油脂的生成很少;發(fā)酵的72～120 h，主要為油脂合成階段，此時(shí)菌體已基本停止生長，油脂含量迅速增至44.9 g/100g細(xì)胞干重;發(fā)酵的120 h以后，檸檬酸產(chǎn)量大幅提高，直至發(fā)酵結(jié)束，檸檬酸產(chǎn)量達(dá)到最高(33.6 g/L)。而此期間油脂含量基本保持恒定，只在發(fā)酵后期出現(xiàn)輕微下降，原因可能是有少量油脂被水解用于檸檬酸的合成。由此可見，Y.lipolytica利用地溝油發(fā)酵過程包括3個(gè)階段:細(xì)胞生長階段，油脂合成階段和檸檬酸合成階段，這與之前Makri等報(bào)道的結(jié)果基本吻合［15］。

圖6 發(fā)酵過程產(chǎn)物產(chǎn)量變化Fig 6 Time course of cell growth，citric acid production and the accumulation of intracellular lipid.

據(jù)Levinson等報(bào)道，Y.lipolytica YB-423以甘油為原料時(shí)能夠產(chǎn)生21.6 g/L檸檬酸［4］;Y.lipolytica ACA-DC 50109以橄欖處理廠廢料為原料發(fā)酵檸檬酸的產(chǎn)量為28.9 g/L［16］，而本研究中以地溝油為原料時(shí)發(fā)酵檸檬酸產(chǎn)量則達(dá)33.6 g/L，這說明與其他碳源相比，地溝油是Y.lipolytica發(fā)酵檸檬酸的良好原料。在生產(chǎn)胞內(nèi)油脂方面，趙春海等報(bào)道Y.lipolytica ACA-DC50109分別以葡萄糖、果糖、蔗糖及菊粉等糖類物質(zhì)為原料的胞內(nèi)油脂產(chǎn)量均僅為30.0 g/100g細(xì)胞干重左右［17］，而 Y.lipolytica SWJ-1b以地溝油為原料時(shí)的胞內(nèi)油脂累積量則達(dá)到44.9 g/100g細(xì)胞干重，表明地溝油作為生產(chǎn)胞內(nèi)油脂的原料同樣具有明顯優(yōu)勢。

2.6 地溝油和胞內(nèi)油脂成分比較

利用氣相色譜法分別分析地溝油及胞內(nèi)油脂的主要脂肪酸成分，結(jié)果如表1所示。從表1可以看出，胞內(nèi)油脂中，飽和脂肪酸油酸的含量遠(yuǎn)低于地溝油，而亞油酸及亞麻酸等不飽和脂肪酸的含量則高于地溝油，這說明地溝油經(jīng)微生物利用并生成胞內(nèi)油脂的過程中，油脂的飽和性降低。Papanikolaou等研究發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)油脂的飽和性與底物濃度及發(fā)酵時(shí)間有密切關(guān)系，底物濃度越高，胞內(nèi)油脂的不飽和度就越高［18］，原因可能在于微生物胞內(nèi)與脂肪酸合成有關(guān)的酶受著底物濃度及發(fā)酵時(shí)間的調(diào)控。

表1 地溝油及胞內(nèi)油脂主要脂肪酸組成 %Table 1 Fatty acid composition of illegal cooking oil and the intracellular lipid of Y.lipolytica SWJ-1b

3 結(jié)論

本文以Y.lipolytica SWJ-1b為發(fā)酵菌株，利用地溝油進(jìn)行檸檬酸和胞內(nèi)油脂的同時(shí)發(fā)酵，并對該發(fā)酵過程中檸檬酸和胞內(nèi)油脂同時(shí)保持較高產(chǎn)量的最佳條件進(jìn)行探索，在最佳發(fā)酵條件下，檸檬酸和胞內(nèi)油脂的產(chǎn)量分別達(dá)到33.6 g/L和44.9 g/100g細(xì)胞干重，該發(fā)酵過程包括3個(gè)階段，即細(xì)胞生長階段，油脂合成階段和檸檬酸合成階段。地溝油合成胞內(nèi)油脂后，其脂肪酸飽和程度降低。由此可見，地溝油是Y.lipolytica SWJ-1b聯(lián)產(chǎn)檸檬酸和胞內(nèi)油脂的理想原料。

［1］ Soccol C R，Vandenberghe L P S，Cristine R.New perspectives for citric acid production and application ［J］.Food Technology and Biotechnology，2006，44(2):141-149.

［2］ 劉曉燕.海洋解脂耶羅維亞酵母菌產(chǎn)檸檬酸的研究［D］.青島:中國海洋大學(xué)，2012.

［3］ TANG X，F(xiàn)ENG H，TANG W.Metabolic engineering for enhanced fatty acids synthesis in Saccharomyces cerevisiae［J］.Metabolic Engineering，2013，16(1):95-102.

［4］ Levinson W E，Kurtzman C P，Kuo T M.Characterization of Yarrowia lipolytica and related species for citric acid production from glycerol［J］.Enzyme and Microbial Technology，2007，41(3):292-295.

［5］ Kamzolova S V，Morguno I G，Aurich A，et al.Lipase secretion and citric acid production in Yarrowia lipolytica yeast grown on animal and vegetable fat［J］.Food Tech-nology and Biotechnology，2005，43(2):113-122.

［6］ Darvishi F，Nahvi I，Zarkesh-Esfahani H，et al.Effect of plant oils upon lipase and citric acid production in Yarrowia lipolytica yeast［J］.Journal of Biomedicine and Biotechnology，2009(1):1-7.

［7］ Kamzolova S V，Lunina J N，Morgunov I G.Biochemistry of citric acid production from rapeseed oil by Yarrowia lipolytica yeast［J］.Journal of the American Oil Chemists'Society，2011，88(12):1 965-1 976.

［8］ Tai M，Stephanopoulos G.Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolyticafor biofuel production ［J］.Metabolic Engineering，2013，15(1):1-9.

［9］ 黃韜睿，王鑫.通過氣相色譜法分析脂肪酸組成鑒別地溝油的方法研究［J］.生命科學(xué)儀器，2013(11):12-15.

［10］ 何東平，陳濤.微生物油脂學(xué)［M］.北京:化學(xué)化工出版社，2005:36-37.

［11］ ZHAN H.Determination of oil content in wastewater by ultraviolet spectrophotometry［J］.Chemical Journal on Internet，2009，11(9):41-45.

［12］ 周建新，彭雪霽，姚明蘭，等.黑曲霉液態(tài)發(fā)酵陳化稻米生產(chǎn)檸檬酸的研究［J］.食品科學(xué)，2008，29(9):370-372.

［13］ LIU X Y，CHI Z，LIU G L，et al.Inulin hydrolysis and citric acid production from inulin using the surface-engineered Yarrowia lipolytica displaying inulinase［J］.Metabolic Engineering，2010，12(5):469-476.

［14］ Anita R，Waldemar R.High-yield production of citric acid by Yarrowia lipolytica on glycerol in repeated-batch bioreactors［J］.Journal of Industrial Microbiology ＆ Biotechnology，2010，37(5):431-435.

［15］ Makri A，F(xiàn)akas S，Aggelis G.Metabolic activities of biotechnological interest in Yarrowia lipolytica grown on glycerol in repeated batch cultures［J］.Bioresource Technology，2010，101(7):2 351-2 358.

［16］ Papanikolaou S，Galiotou-Panayotou M，F(xiàn)akas S，et al.Citric acid production by Yarrowia lipolytica cultivated on olive-mill waste water-based media［J］.Bioresource Technology，2008，99(7):2 419-2 428.

［17］ ZHAO C H，CUI W，LIU X Y，et al.Expression of inulinase gene in the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica and single cell oil production from inulin-containing materials［J］.Metabolic Engineering，2010，12(6):510-517.

［18］ Papanikolaou S，F(xiàn)akas S，F(xiàn)ick M，et al.Biotechnological valorisation of raw glycerol discharged after bio-diesel(fatty acid methyl esters)manufacturing process:Production of 1，3-propanediol，citric acid and single cell oil［J］.Biomass and Bioenergy，2008，32(1):60-71.