樓炬峰 姚則慶 陳光柱

(嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 嘉興314001)

石墨化碳纖維或離子液體修飾電極都可以有效提高電極性能[1-2]。在過氧化氫酶研究領(lǐng)域，Pamula E和Rouxhet PG細致研究了碳纖維吸附過氧化氫酶（Cat）的行為及影響因素，發(fā)現(xiàn)碳纖維的表面功能對過氧化氫酶的吸附具有一定的影響，含有生物相容性基團的碳纖維對過氧化氫酶表現(xiàn)較好的吸附性能[3]。Saadati,S(Saadati,Shagayegh)等將過氧化氫酶與氨基化離子液體層層組裝到鈦基納米管表面，探究了過氧化氫酶的直接電子傳遞行為，以及構(gòu)建在電子傳遞基礎(chǔ)之上的過氧化氫傳感器，充分體現(xiàn)了其靈敏性與生物相容性[4]。Chen等進一步研究了離子液體和DNA的復(fù)合物對幾種氧化還原蛋白質(zhì)的電子傳遞促進行為，研究發(fā)現(xiàn)離子液體對蛋白質(zhì)分子具備很好的生物相容性，實現(xiàn)了蛋白質(zhì)和電極之間的直徑電子傳遞行為，為構(gòu)建相應(yīng)的生物傳感器奠定了很好的前期基礎(chǔ)[5]。電化學(xué)還原制備的氧化石墨烯修飾電極后，可以進一步促進過氧化氫酶的吸附和電子傳遞，結(jié)合的過氧化氫酶對過氧化氫具備非常靈敏的催化性能，線性范圍為0.05到1.91 uM，靈敏度達7.76 uA mM-1 cm-2[6]。

至今，石墨化碳纖維-離子液體復(fù)合物修飾電極構(gòu)建過氧化氫酶的研究還未見報道，開展該領(lǐng)域的實驗具有一定的探索意義和研究價值。本項目將首先制備石墨化碳纖維-離子液體的復(fù)合材料，并將其用于過氧化氫酶的電子傳遞研究領(lǐng)域，探討酶結(jié)構(gòu)和性能、組建新型傳感器。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

CHI-660B型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司）；S-4800型掃描電子顯微鏡（日本日立公司）。石墨化碳纖維GNFS(中國科學(xué)院成都有機化學(xué)有限公司)，使用之前經(jīng)濃硫酸-濃硝酸混合液（體積比3:1）進一步純化；1-羧丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽、1-羧甲基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（IL），中國科學(xué)院蘭州化物所）；過氧化氫酶Cat（美國Sigma公司），用時當(dāng)天配制；實驗室用水為超純水。

1.2 復(fù)合材料的制備及修飾電極構(gòu)建

取15μL 1-羧丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽和5 mg GNFS于瑪瑙研體A中，取15μL 1-羧甲基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽和5 mg GNFS于瑪瑙研體B中，各研磨1小時，放置30min后，分別將它們轉(zhuǎn)移至離心管，超聲清洗、離心，去除未結(jié)合的離子液體，得到石墨化碳纖維1-羧甲基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽復(fù)合物（記做GNFS-IL（A））和石墨化碳纖維1-羧丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽復(fù)合物（記做GNFS-IL（B）），分別分散到5ml水中備用。取6mgCat溶解于1ml中，制得6 mg/ml（前后形式一致）的Cat溶液。

取上述各分散液20μL滴到磨平、洗凈、曬干的玻碳電極表面，自然揮發(fā)后，形成薄且均勻的修飾層，即制得復(fù)合物修飾（玻碳）電極（GNFS-IL（A）/GCE,GNFS-IL（B）/GCE）。之后，各修飾電極浸入6 mg/ml的Cat溶液中，過夜，取出水洗，待用。

1.3 實驗方法

電化學(xué)檢測采用三電極體系：復(fù)合物修飾（玻碳）電極為工作電極，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極，鉑電極為對電極。以0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS）為底液，通入純氮氣除去溶解氧、并保持氮氣氛圍。實驗均在室溫下進行。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合物的掃描電鏡特征

纖維是指長度比直徑大千倍以上且具有一定柔韌性和強力的纖細物質(zhì)。圖1分別是GNFS-IL（A）和GNFS-IL（B）復(fù)合物的掃描電鏡(SEM)圖。從圖中可以看出：兩種復(fù)合物中已基本觀察不到GNFS的纖維結(jié)構(gòu)，并且在一定程度上表現(xiàn)出黏連的現(xiàn)象，在GNFS-IL（A）圖中表現(xiàn)得比較清晰，有大片粘在一起的形態(tài)，整體呈片狀，且片狀面積較大。而相較于GNFS-IL（A），GNFS-IL（B）局部圖則比較整齊規(guī)則，出現(xiàn)了小范圍的黏連，片狀面積較小，除了小碎片狀的形態(tài)，還有一些條狀的形態(tài)。以上特征的出現(xiàn)主要是由于GNFS和IL之間的結(jié)合，IL的凝膠膜引發(fā)了GNFS表面形態(tài)上的變化。

圖1 復(fù)合物的掃描電鏡圖

2.2 循環(huán)伏安法（CV）

圖2為復(fù)合物修飾（玻碳）電極,GNFS-IL（A）/GCE,GNFS-IL（B）/GCE）浸入6 mg/ml的Cat溶液中，過夜，取出水洗，置于0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中，經(jīng)過幾次循環(huán)伏安掃描后得到的伏安循環(huán)圖。兩電極在相同條件下進行循環(huán)伏安掃描，都出現(xiàn)了氧化還原信號。其中a圖是GNFS-IL（A）復(fù)合物的掃描圖像，在-0.46V(vs.SCE）左右可觀察到一對△Ep=Epa-Epc=0.489 V-0.439 V=0.05 V，即50 mV左右的還原氧化峰。而b圖是復(fù)合物GNFS-IL（B）的掃描圖像，在-0.47 V(vs.SCE）左右可觀察到一對△Ep=Ep a-E pc=0.488 V-0.443 V=0.045 V，即45 mV左右的還原氧化峰。從圖中不難發(fā)現(xiàn)，石墨化碳纖維—1-羧甲基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽復(fù)合物表現(xiàn)出了更好的電化學(xué)響應(yīng)，氧化還原電對的特征峰更加明顯。經(jīng)過多次重復(fù)試驗，結(jié)果也印證了這一點：Cat在GNFS-IL（A）復(fù)合物修飾的電極上可以更好的實現(xiàn)其與電極的直接電子傳遞。所以在研究后續(xù)相關(guān)的問題時我們將會更多的關(guān)注GNFS-IL（A）復(fù)合物。

圖2 伏安循環(huán)圖

GNFS-IL（A）制得的伏安循環(huán)曲線中可以看出，其陰極峰電勢Epc為-0.489 V，陽極峰電勢Epa為-0.439 V，電勢差為50 mV，式電勢E0以（Epc+Epa）/2=-0.464 V，這是Cat血紅素輔基中氧化還原中心Fe(III)/Fe(II)的氧化還原特征峰。在此范圍內(nèi)，用高溫處理的Cat進行實驗，并沒有出現(xiàn)氧化還原峰，也印證了上面的觀點。

隨著掃描速度的增加，峰電流不斷增大，而且還原峰電位負移,氧化峰電位正移。而△Ep都在50 mV以內(nèi)，表明在GNFS-IL（A）/GCE中Cat的電子傳遞可逆程度較高，一方面是因為IL凝膠膜為Cat提供了微水環(huán)境，有利于保持其分子活性[7-8]；另一方面，GNFS-IL具備良好的生物相容性和導(dǎo)電性，可與Cat進行快速的電子傳遞。根據(jù)準可逆薄層電化學(xué)過程的Laviron方程[9]可求出電活性物質(zhì)發(fā)生電極反應(yīng)時的電子轉(zhuǎn)移數(shù)為0.927（≈1），說明GNFS-IL（A）/GCE中的Cat發(fā)生了單電子轉(zhuǎn)移準可逆的氧化還原過程。

2.3 pH值對循環(huán)伏安行為的影響

圖3為不同pH條件下的Cat響應(yīng)，用磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉制備了pH分別為3,4,5,6,7,8,9,10,11的緩沖溶液，分別針對復(fù)合物GNFS-IL（A）制得伏安循環(huán)圖，但為了更好地在一張圖中呈現(xiàn)出來，這里只選出pH為2.99,5.01,7.00的緩沖溶液下的Cat響應(yīng)。可以觀察到，隨著底液pH值的增大，復(fù)合物修飾（玻碳）電極的循環(huán)伏安陰陽兩極峰電位均發(fā)生明顯負移，而峰形，峰電流沒有明顯變化。將CV陰極峰電位和陽極峰電位的平均值E0，作為Cat電對式量電位的近似值，來考察pH值對式量電位的影響[10]（如圖4）。結(jié)果表明，E0，與pH值之間存在良好的線性關(guān)系，其斜率為-49.3 mV/pH。由圖可得，在pH 3.0到8.0之間時，其斜率的絕對值其實大于49.3 mV/pH，這樣實驗值就更接近18。C時可逆體系的理論值-57.7 mV/pH說明復(fù)合物修飾的（玻碳）電極中的Cat發(fā)生一個電子轉(zhuǎn)移的同時還有可能伴隨一個質(zhì)子的轉(zhuǎn)移。但當(dāng)pH值大于8時，斜率的絕對值就變小了，說明E0，隨pH值變化的趨勢變緩。

3 結(jié)論

憑借IL優(yōu)良的溶解性，通過研磨它和GNFS的混合物，制備了新型的二元復(fù)合物。然后在GNFS-IL/GCE上修飾的Cat表現(xiàn)出了良好的電化學(xué)響應(yīng)，顯示Cat發(fā)生了單電子轉(zhuǎn)移準可逆的氧化還原過程。體系的pH對循環(huán)伏安峰的位置有明顯的影響，且復(fù)合物修飾的（玻碳）電極中的Cat發(fā)生一個電子轉(zhuǎn)移的同時還有可能伴隨一個質(zhì)子的轉(zhuǎn)移。結(jié)果表明GNFS-IL/GCE在構(gòu)建過氧化氫酶傳感器研究領(lǐng)域具備潛在的應(yīng)用前景。

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