唐應華， 陸吉虎， 吳培培， 查國飛，4， 劉振興，2， 陳 輝， 侯繼波

(1.江蘇省農業(yè)科學院國家獸用生物制品工程技術研究中心/農業(yè)部獸用生物制品工程技術重點實驗室，江蘇 南京210014;2.南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇 南京210095;3.南京天邦生物科技有限公司，江蘇 南京211102;4.安徽農業(yè)大學動物科技學院，安徽 合肥230036)

H5 和H9 亞型禽流感滅活油乳劑疫苗在中國禽流感防控中發(fā)揮了重大作用，但現有疫苗質量有待進一步提高，如加速抗體產生、延長免疫持續(xù)期等。在臨床生產中，種禽或蛋禽的生產周期內，需要多次免疫，每增加一次免疫均對動物帶來較大應激，影響生產性能，同時也增加人力成本，臨床生產中亟需一種佐劑能有效延長疫苗免疫持續(xù)期。

免疫增強劑與疫苗共同使用，具有較好的協同效應，可以提高疫苗抗原的免疫效力，延緩抗原的釋放等。人用流感疫苗免疫增強劑MF59 已經在歐洲應用多年［1］，美國FDA 也已批準［2］。葛蘭素史克公司的人流感疫苗使用AS03 佐劑［3］;Intervet 的豬圓環(huán)病毒疫苗和繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗均使用Diluvac Forte 佐劑［4-5］;Boehringer 的豬圓環(huán)病毒疫苗使用Ingelvac CircoFLEX 佐劑［6］;Pfizer 的豬圓環(huán)病毒疫苗使用Suvaxyn 佐劑［7］;豬支原體疫苗、偽狂犬疫苗和細小病毒疫苗等使用Amphigen 佐劑［8］;Seppic 公司的口蹄疫疫苗使用ISA206 佐劑，新城疫疫苗使用ISA70 佐劑［9-10］。

本研究中，我們將篩選的免疫增強劑以不同形式添加至疫苗中，評價免疫增強劑對疫苗免疫持續(xù)期和安全性以及對免疫雞淋巴細胞轉化的影響。

1 材料和方法

1.1 病毒、疫苗和檢測抗原

H5 亞型禽流感商品疫苗和H5 檢測抗原，均購自哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司。H9 亞型禽流感疫苗由本實驗室制備，疫苗毒株和檢測用抗原均為A/Chicken/Nanjing/02/2001(H9N2，簡稱NJ02)。

1.2 雞

1 日齡商品海蘭褐雞購自海安通榆種雞場，在普通環(huán)境飼養(yǎng)至使用，檢測針對H5 或H9 亞型禽流感母源抗體，僅抗體低于2lg2 時用于免疫。無特定病原體(Specific pathogen free，SPF)雞購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司，養(yǎng)在負壓隔離器內，直至使用。

1.3 含免疫增強劑疫苗的配制

含VA5 免疫增強劑疫苗的配制詳見專利(申請?zhí)?01210235427.0)。增強劑的使用形式有2 種，一種以疫苗伴侶形式使用:將免疫增強劑配制成油乳劑疫苗伴侶，使用時將該疫苗伴侶與H5 常規(guī)疫苗按體積比為1∶ 9 混合，即為含VA5 免疫增強劑的伴侶疫苗(VA5-H5);另一種是免疫增強劑與H9 疫苗抗原共同混勻形式使用:將免疫增強劑直接添加至抗原溶液中混勻后，制備水相，再與事先制備的油相混勻，制備含免疫增強劑的H9 疫苗(VA5-H9)。

1.4 免疫持續(xù)期

選擇10 日齡海蘭褐蛋雞，共設4 個免疫組，包括VA5-H5 伴侶疫苗免疫組和H5 常規(guī)疫苗免疫組(H5);VA5-H9 共混疫苗免疫組和H9 常規(guī)疫苗免疫組。海蘭褐蛋雞均經頸背部皮下免疫，每只雞注射0.3 ml。另設空白對照組。免疫和空白組每組各20 只雞。在免疫后第2 周、第3 周、第4 周以及后續(xù)每隔2 周采血，其中VA5-H5 和H5 疫苗免疫組檢測至免疫后26 周，而VA5-H9 和H9 疫苗免疫組檢測至免疫后30 周。分離血清檢測血凝抑制抗體效價(HI)。根據H5 疫苗制造規(guī)程，設定HI高于或等于7lg2 為合格抗體效價，低于7lg2 為不合格抗體效價。對于H9 疫苗，設定HI高于或等于6lg2 為合格抗體效價，低于6lg2 為不合格抗體效價。

1.5 含免疫增強劑疫苗的安全性檢測

1.5.1 單劑量接種安全性 2 批次含免疫增強劑的疫苗(VA5-H9)和常規(guī)疫苗(H9)單劑量各免10只雞，共3 組，每只雞經頸部皮下注射疫苗0.3 ml。另設不免疫的空白對照組10 只雞。

1.5.2 雙倍劑量接種安全性 2 批次含免疫增強劑的疫苗(VA5-H9)和常規(guī)疫苗(H9)雙倍劑量各免10 只雞，共3 組，每只雞經頸部皮下分兩點注射疫苗0.6 ml。另設不免疫空白對照組10 只雞。

1.5.3 單劑量重復接種安全性 2 批次含免疫增強劑的疫苗(VA5-H9)和常規(guī)疫苗(H9)單劑量各免10只雞，共3 組，每只雞經頸部皮下注射疫苗0.3 ml。第1 次接種后2 周，按第一次接種方法再次接種，每只雞頸部皮下注射0.3 ml。另設不免疫空白對照組10 只雞。上述接種雞在最后一次注射疫苗后，均觀察14 d，詳細記錄采食飲水等情況。觀察期結束后，撲殺5 只，觀察注射部位的疫苗吸收情況。再過14 d后將剩下的5 只撲殺，觀察疫苗吸收情況。

1.6 雞淋巴細胞轉化

VA5-H9 疫苗和H9 疫苗分別免疫14 日齡無特定病原體SPF 雞，另設空白對照，每組10 只SPF 雞。在免疫后第1 d、3 d、5 d、7 d、10 d 放血處死各組2只雞，無菌分離免疫雞的脾臟淋巴細胞，于96 孔板每孔加100 μl 1 ml 1 ×106的淋巴細胞，每個樣品設置3 個重復，于37 ℃孵育4 h 后，加入25 μg/ml的PHA 刺激培養(yǎng)68 h 后，每孔加入15 μl 濃度為5 mg/ml的MTT，孵育6 ～8 h 后加入50 μl DMSO，于分光光度計上讀數，檢測OD570值。按每3 個重復樣品的平均值計算刺激指數，即疫苗免疫組OD570均值/空白對照組OD570均值。刺激指數與免疫效力呈正相關性，即刺激指數值越高表示免疫效力越好。

2 結果與分析

2.1 添加VA5 免疫增強劑的H9 疫苗的免疫持續(xù)期

將免疫增強劑VA5 與H9 抗原共同混勻后，制備疫苗免疫雞，持續(xù)監(jiān)測抗體效價。含免疫增強劑疫苗免疫后至第6 周一直處于抗體上升期，直至第30 周抗體效價下降至6lg2 以下，常規(guī)H9 疫苗免疫組抗體類似于含免疫增強劑組，抗體上升至第6 周達到高峰，抗體效價在第22 周低于6lg2。對照組母源抗體一直低于2lg2。含免疫增強劑H9 免疫組抗體水平一直高于常規(guī)H9 疫苗免疫組，且在18 周之前一直高于1.8lg2 以上(圖1)。以疫苗規(guī)程要求的6lg2 作為合格抗體界限，添加免疫增強劑的H9疫苗比常規(guī)H9 疫苗能延長抗體持續(xù)期4 周。

2.2 添加VA5 免疫增強劑的H5 疫苗的免疫持續(xù)期

將免疫增強劑VA5 制備成油乳劑疫苗伴侶，再與H5 商品疫苗共同混勻后免疫雞，持續(xù)監(jiān)測抗體效價。含免疫增強劑疫苗免疫后，第2 周抗體達到7lg2，在第3 周達到高峰，一直維持至第12 周，之后逐漸下降，在第24 周抗體效價低于7lg2;常規(guī)疫苗在免疫后第2 周抗體僅為4.25lg2，在第3 周至第10周維持較高抗體水平，之后逐漸下降，在第20 周抗體效價低于7lg2;空白對照組一直未檢測出抗體(圖2)。與常規(guī)H5 疫苗相比，含免疫增強劑VA5-H5疫苗免疫后，合格抗體產生提前1 周，即縮短窗口保護期1 周;在免疫后14 周前，VA5-H5 組抗體效價高于常規(guī)H5 疫苗2lg2 以上;常規(guī)疫苗在免疫后第20周降至7lg2 以下，而VA5-H5 疫苗免疫組至第24 周降至7lg2 以下，即VA5-H5 延長抗體持續(xù)期4 周。

圖1 H9 疫苗免疫后抗體持續(xù)期Fig.1 Duration of immunity provided by H9 vaccine

圖2 H5 疫苗免疫后抗體持續(xù)期Fig.2 Duration of immunity provided by H5 vaccine

2.3 添加免疫增強劑的疫苗安全性

2 批次含免疫增強劑疫苗經單劑量接種雞，或兩倍超劑量接種雞，或經間隔2 周單劑量重復接種雞，在最后一次接種后撲殺，肉眼觀察疫苗吸收情況。

2.3.1 單劑量免疫試驗 在免疫后第14 d，各組撲殺5 只雞，檢查疫苗吸收情況。其中VA5-H9 疫苗第一批次、第二批次組和常規(guī)H9 疫苗組均有2 只雞在頸部皮下免疫處有淡黃色類脂肪粒，常規(guī)疫苗組另有1 只有乳白色顆粒和彌散性淡黃色類脂肪粒。各組其余剖檢雞均正常。在第28 d 剖檢時，VA5-H9 疫苗第一批次免疫組有1 只雞、第二批次免疫組有3 只雞，常規(guī)疫苗組有2 只雞有淡黃色類脂肪粒，各組其余剖檢雞均正常。非免疫的空白對照組在第14 d 和第28 d 均正常。3 組雞在免疫后的觀察期內均健康，飲食正常。

2.3.2 超劑量免疫試驗 在免疫后第14 d，VA5-H9 疫苗第一批次組和常規(guī)疫苗組5 只雞均在頸部皮下免疫處有淡黃色類脂肪粒;VA5-H9 疫苗第二批次組2 只雞在頸部皮下免疫處有淡黃色類脂肪粒，另3 只雞均正常。在第28 d 剖檢時，VA5-H9 疫苗第一批次和第二批免疫組均有2 只雞以及常規(guī)疫苗組5 只雞均有淡黃色類脂肪粒，其余剖檢雞均正常。非免疫的空白對照組在第14 d 和第28 d 均正常。3 組雞在免疫后的觀察期內均健康，飲食正常。

2.3.3 單劑量重復免疫試驗 在二免后第14 d，VA5-H9 疫苗第一批次免疫組3 只雞有乳白色顆粒，2 只雞有乳白色顆粒和黃色類脂肪混合顆粒。VA5-H9 疫苗第二批次免疫組中1 只雞有乳白色顆粒，4 只雞有淡黃色類脂肪顆粒。常規(guī)疫苗組的2只雞有乳白色顆粒，3 只雞有乳白色和淡黃色類脂肪混合顆粒。在二免后第28 d，VA5-H9 疫苗第一批次免疫組和常規(guī)疫苗組，均有2 只雞在免疫部位有淡黃色類脂肪樣顆粒，另3 只正常。而VA5-H9疫苗第二批次免疫組，1 只雞有白色顆粒狀未吸收完全的疫苗，另1 只有淡黃色脂肪樣顆粒，剩余3 只雞均正常。不免疫的空白對照組均正常。3 組雞在免疫后的觀察期內均健康，飲食正常。

根據各組在免疫后不同時期的疫苗吸收情況比較可以得知，含免疫增強劑的2 批次疫苗，與常規(guī)疫苗的吸收情況較類似，無明顯延后。該結果提示，將免疫增強劑添加至疫苗中，并不影響機體對疫苗的吸收。

2.4 VA5 免疫增強劑對免疫雞淋巴細胞轉化效率的影響

各疫苗免疫組雞的淋巴細胞在免疫后，刺激指數逐漸升高，即淋轉活性逐漸上升，且含VA5 免疫增強劑劑的滅活疫苗組的淋巴細胞轉化活性高于常規(guī)疫苗組，特別在第5 d 以后更加明顯(圖3)。根據刺激指數與免疫效力的正相關性可以得知，免疫增強劑提高免疫雞的淋巴細胞轉化活性，即含免疫增強劑疫苗能提高機體對疫苗的免疫應答。這與抗體檢測結果中含免疫增強劑的疫苗抗體效價高一致。

圖3 添加VA5 免疫增強劑的疫苗免疫雞后的淋巴細胞轉化Fig.3 The lymphocyte transformation of chicken inoculated with VA5-contained vaccine

綜上所述，本研究獲得的免疫增強劑，無論以添加至抗原中混合使用的形式或以疫苗伴侶的形式使用，均能有效提高雞對禽流感疫苗的抗體效價和免疫持續(xù)期。安全性研究表明，該免疫增強劑不影響雞體對疫苗的吸收。

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