徐 海， 王義偉， 鮑 熹， 李鵬程， 鄭其升， 侯繼波

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院，國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京210014)

促性腺激素釋放激素(Gonadotropin releasing hormone，GnRH)是下丘腦合成、分泌的神經(jīng)激素，它和腦垂體促性腺激素分泌細胞的特異性受體結(jié)合后刺激促性腺激素的產(chǎn)生和釋放，在動物生殖過程中扮演重要角色［1］。主動免疫GnRH 會使體內(nèi)產(chǎn)生GnRH 抗體，進而中和內(nèi)源性的GnRH，打破下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)平衡，下調(diào)促性腺激素的分泌，使性腺發(fā)育受阻、睪丸萎縮［2-4］。

GnRH 是由焦谷-組-色-絲-酪-甘-亮-精-脯-甘酰胺組成的直鏈式10 肽［5］，從鼠到人類的不同物種，GnRH 的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)高度保守，甚至在哺乳動物中除豚鼠外都是完全一致的;而對于同一物種，兩種性別都具有GnRH 分子，并且具有相同的生物活性。這個優(yōu)勢使得GnRH 的主動免疫具有廣闊的應用范圍，可以替代公豬手術(shù)去勢提高生產(chǎn)效率以及犬貓等伴侶動物避孕、終止妊娠［6-8］。

GnRH 作為10 肽小分子自身免疫原性很弱，需要與大分子偶聯(lián)來提高免疫原性，促進抗體的產(chǎn)生與維持。T7 噬菌體gp10B 經(jīng)過改造可用于外源多肽的表面展示，此時噬菌體既是半抗原多肽的表達載體，同時其顆粒樣的結(jié)構(gòu)也是抗原遞呈載體。本研究試圖將3 拷貝GnRH 多肽在T7 噬菌體表面進行高效展示，構(gòu)建重組噬菌體疫苗免疫小鼠，評價免疫去勢效果，旨在為GnRH 主動免疫在動物中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

T7 Select 415-1b cloning kit 購于德國Merck 公司;3 拷貝GnRH基因(pUC-3GnRH)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 工具酶和試劑

限制性內(nèi)切酶、TaqDNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶為大連寶生物公司產(chǎn)品;蛋白預染Marker 為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;DAB 顯色試劑盒為武漢博思德公司產(chǎn)品;羊抗鼠、兔二抗購于KPL 公司;其余試劑均為分析純。

1.3 試驗小鼠

9 周齡清潔級雄性小鼠購于南京醫(yī)科大學試驗動物中心，飼養(yǎng)于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院試驗動物中心。

1.4 重組噬菌體的構(gòu)建、鑒定

將人工合成的3 拷貝基因pUC-3GnRH經(jīng)EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，回收151 bp 目的片段，與試劑盒中經(jīng)同樣酶切處理的T7基因組連接。連接產(chǎn)物經(jīng)包裝蛋白包裝，用瓊脂糖夾心法測定包裝效率，挑取噬菌斑經(jīng)PCR 方法鑒定陽性重組克隆，PCR 擴增產(chǎn)物送華大基因測序。具體操作參見試劑盒說明書。

1.5 重組噬菌體的擴增及Western-blot 分析

37 ℃搖床培養(yǎng)200 ml 的BL21 宿主細菌至OD600=1.0 左右，以MOI=0.01 接種噬菌體，繼續(xù)37 ℃搖床培養(yǎng)2 ～3 h 直至宿主菌完全裂解，5 000 r/min離心15 min 回收上清液中重組噬菌體，用PEG 沉淀法濃縮噬菌體顆粒，10 ml SM 緩沖液重懸離心沉淀，瓊脂糖夾心法測定回收產(chǎn)物滴度。取10 μl 濃縮產(chǎn)物進行SDS-PAGE 檢測，同時用兔抗Gn-RH 抗體(上海吉爾生化公司制備)進行Westernblot 檢測，展示多肽免疫反應性。

1.6 疫苗制備及免疫

將擴增的噬菌體調(diào)整濃度到3 ×1011PFU/ml，0.1% BEI(二乙烯亞胺)滅活。噬菌體抗原與白油佐劑以1∶ 2 體積比乳化制備疫苗。免疫9 周齡雄性小鼠，每組15 只，每只0.1 ml 腿部肌肉注射免疫，首免后4 周同等劑量加強免疫1 次。T7-GnRH噬菌體疫苗、輝瑞公司ImproVac 疫苗對照及空白對照3 個試驗組，免疫后每周眼球采血。

1.7 檢測指標

1.7.1 抗體水平測定 以本實驗室建立的ELISA方法檢測抗GnRH 抗體。BSA-3GnRH 多肽5 μg/ml濃度包被ELISA 板;1% BSA 37 ℃封閉3 h，待檢血清1∶ 200 稀釋，37 ℃反應1 h;工作濃度二抗37 ℃反應1 h;TMB 底物顯色10 min，2 mol/L H2SO4終止讀數(shù)。

1.7.2 睪酮含量測定 用血清睪酮放免分析試劑盒測定，由南京軍區(qū)總醫(yī)院放免科協(xié)助完成。

1.7.3 睪丸指數(shù) 免疫后第12 周稱量小鼠體質(zhì)量，每組剖檢10 只小鼠，摘取小鼠左、右側(cè)睪丸用電子天平測質(zhì)量，計算睪丸指數(shù)(雙睪質(zhì)量/當日體質(zhì)量×100%)。

1.7.4 睪丸組織學觀察 取睪丸組織，波恩氏液固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 重組噬菌體的鑒定

挑取噬菌斑進行PCR 檢測，成功擴增出250 bp目的條帶，與設(shè)計大小相符合(圖1);同時設(shè)T7 Select 415-1b 的基因組為對照，擴增產(chǎn)物為多克隆位點兩側(cè)約100 bp 片段。序列測定結(jié)果顯示插入片段的序列完全正確，閱讀框無移碼。

圖1 重組噬菌體PCR 鑒定Fig.1 Identification of recombinant phage by PCR

2.2 重組噬菌體擴增及蛋白質(zhì)鑒定

T7-3GnRH 培養(yǎng)上清液測定滴度為7.8 × 1010PFU/ml，經(jīng)PEG-NaCl 濃縮后沉淀定容到10 ml，測定滴度為8.4 ×1011PFU/ml。重組噬菌體與T7 Select 415-1b 噬菌體同時進行SDS-PAGE 檢測，不能直接區(qū)分展示GnRH 目的蛋白(圖2-A);Westernblot 檢測顯示在43 000處有特異性條帶顯色，大小與預計相符，且無雜帶(圖2-B)。說明GnRH 多肽在噬菌體表面成功展示，具有良好的免疫反應性。

2.3 GnRH 抗體水平

以人工合成的BSA-3GnRH 肽包被酶標板，檢測免疫小鼠血清，結(jié)果見圖3。可以看出，T7-3GnRH 首次免疫后抗體迅速升高，加強免疫后抗體上升幅度減小，在第6 周達到高峰(抗體OD450值為0.9)。商品苗首次免疫后抗體升高緩慢，加強免疫后升高，在第6 周達到高峰(抗體OD450值為0.7)。對照組只檢測到本底水平的抗體。

2.4 血清睪酮水平

從圖4 可以看出，性成熟雄性小鼠睪酮水平相對穩(wěn)定，對照組小鼠血清睪酮含量維持在9 ng/ml左右。免疫組在GnRH 抗體中和效應作用下，睪酮水平逐漸下降。在抗體水平較高的8 周，其睪酮水平最低，在12 周時抗體呈下降趨勢，睪酮含量開始回升。睪酮含量與抗體水平呈負相關(guān)性。T7-3GnRH 免疫組與ImproVac 免疫組在免疫后4 周血清睪酮含量差異顯著，第8 周、12 周差異不顯著。

2.5 睪丸指數(shù)

免疫后第12 周剖檢小鼠，每組10 只小鼠，計算睪丸指數(shù)，SPSS statistics 軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果見表1。免疫組體質(zhì)量高于對照組，免疫組之間沒有顯著差異;而睪丸質(zhì)量、睪丸指數(shù)均低于對照組，且差異顯著。T7-3GnRH 免疫組睪丸質(zhì)量、睪丸指數(shù)低于ImproVac 免疫組，差異顯著。

2.6 睪丸組織學觀察

免疫組小鼠睪丸發(fā)育受到明顯抑制，見圖5。T7-3GnRH 免疫組(圖5-A)、ImproVac 免疫組(圖5-B)小鼠均表現(xiàn)為曲精細管生精上皮細胞萎縮，各級生精細胞層次減少，排序雜亂，管腔內(nèi)無精子或少精子;對照組(圖5-C)生精上皮各級生精細胞排列緊密有序，管腔內(nèi)有大量精子生成。

3 討論

GnRH 作為十肽小分子激素是一個半抗原，本身沒有很好的免疫原性，半抗原增加免疫原性的基本思路就是與大分子載體蛋白結(jié)合。用作載體的蛋白分子分子量須足夠大且能結(jié)合更多的半抗原分子，從而增強其生物活性［9］。GnRH 單體與載體蛋白結(jié)合，如與BSA、KLH、HAS、OVA 結(jié)合，免疫效果理想，因此尋找合適的半抗原載體顯得尤為重要［10-11］。T7 噬菌體衣殼蛋白可以融合表達一定長度的外源多肽，在噬菌體組裝時將外源多肽展示在結(jié)構(gòu)表面;同時噬菌體顆粒本身具有良好的免疫原性，具有天然的佐劑效應，是優(yōu)良的免疫載體。本研究中3 拷貝GnRH基因在T7 噬菌體表面得到表達，Western-blot 檢測顯示展示的GnRH 保持良好的抗體反應性。T7-3GnRH 重組噬菌體疫苗與ImproVac商品疫苗進行免疫效力比較，各項檢測指標均不低于商品疫苗。噬菌體疫苗顆粒樣結(jié)構(gòu)可促進免疫細胞對抗原的遞呈，有效提高免疫效力。

GnRH 主動免疫能下調(diào)體內(nèi)促黃體素的含量，導致性腺發(fā)育受阻，生育能力下降甚至喪失，Meloen 等［12］最早提出GnRH免疫去勢的機理，即GnRH 抗體特異性地中和了動物機體內(nèi)的GnRH，導致動物體內(nèi)GnRH 的生物活性部分或全部喪失。Oliver 等［13］和Zamaratskaia 等［14-15］對輝瑞公司的ImproVac 疫苗進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，主動免疫GnRH能抑制公豬生殖器官的發(fā)育，達到免疫去勢的效果。T7-3GnRH、ImproVac 免疫組小鼠在抗體產(chǎn)生后均表現(xiàn)出血清睪酮含量的下降，高水平抗體持續(xù)6 周后開始下降，此時睪酮含量呈上升趨勢，間接說明抗體在體內(nèi)發(fā)揮中和效應，GnRH 含量減少下調(diào)腦垂體對促黃體素的釋放，從而抑制睪丸的發(fā)育使睪酮含量減少。剖檢小鼠發(fā)現(xiàn)其免疫組睪丸指數(shù)低于對照組，睪丸發(fā)育受阻明顯，睪丸組織學觀察發(fā)現(xiàn)曲精管生精上皮細胞萎縮，各級生精細胞排列混亂，管腔內(nèi)少精子或無精子，直觀反映其發(fā)育受阻的程度。GnRH 主動免疫可作為傳統(tǒng)手術(shù)閹割一種有效替代的方法。

圖2 重組噬菌體T7-3GnRH 的SDS-PAGE 和Western-blot 檢測Fig.2 SDS-PAGE and Western-blot analysis of T7-3GnRH phage

圖3 免疫后各試驗組抗體的變化Fig.3 GnRH antibody levels in each group after vaccination

圖4 免疫后各試驗組睪酮含量Fig.4 Testosterone levels in each group after vaccination

表1 免疫后各試驗組睪丸指數(shù)的比較Table 1 Testis index of each group after vaccination

圖5 小鼠睪丸組織學變化Fig.5 Testis histological changes of mouse

然而，從鼠到人類的不同物種中，GnRH 的主要氨基酸構(gòu)成相對保守，GnRH 主動免疫動物尤其家畜，其疫苗的殘留會不會給人類帶來潛在的風險還有待進一步研究。T7 Select 415-1b 作為人工改造的噬菌體，其專一性識別大腸桿菌BL21 工程菌，離開宿主將不能繁殖，但T7-3GnRH 表面展示有生物學功能的激素分子，作為基因工程產(chǎn)物其生物安全仍需嚴格考察。

本研究只是對構(gòu)建的T7-3GnRH 重組噬菌體做初步免疫效力檢測，并與輝瑞公司ImproVac 疫苗做平行比較，其各項指標均能達到商品苗免疫效果。ImproVac 疫苗僅限公豬使用，本試驗在小鼠上的比對結(jié)果僅限參考，T7-3GnRH 疫苗仍需根據(jù)使用范圍回歸靶標動物做進一步驗證，其生物安全性也需要更多數(shù)據(jù)做出科學判斷。

［1］ FINK G.Gonadortrop in secretion and its control［M］//KNOBLL E，NEILL J D.The physiology of reproduction.New York:Raven Press，1988:1349-1377.

［2］ GARCA-GALIANO D，PINILLA L，TENA-SEMPERE M，et al.Sex steroids and the control of the kiss system:developmental roles and major regulatory actions ［J］.J Neuroendcrinol，2012，24(1):22-33.

［3］ RAO J，CASTELLANO J M，NAVARRO V M，et al.Kisspeptins and the control of gonadotropin secretion in male and female rodents［J］.Peptides，2009，30(1):57-66.

［4］ 秦 津，魯金玉，謝瑩雪，等.促性腺激素釋放激素在中國荷斯坦奶牛卵巢的免疫組化定位［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2012，40(3):162-163.

［5］ YOO M S，KANG H M，CHOI H S，et al.Molecular cloning distribution and pharmacological characterization of a novel gonadotropin releasing hormone in frog brain［J］.Molecular and Cellular Endocrinology，2000，164(1):197-204.

［6］ PRICE E O，ADAMS T E，HUXSOLL C C，et al.Aggressive behavior is reduced in bulls actively immunized against gonadotropin releasing hormone［J］.Anim Sci，2003，81(2):411-415.

［7］ DUNSHER F R，COLANTONI C，HOWARD H，et al.Vaccination of boars with a GnRH (Improve)eliminates boar taint and increase growth performance ［J］.J Anim Sci，2001，79(10):2524-2535.

［8］ PONGLOWHAPAN S.Clinical applications of GnRH aganist deslorelin in dogs and cats［J］.The Journal of Veterinary Medicine，2011，41:59-63.

［9］ 韓興發(fā)，曹曉涵，杜小剛，等.GnRH 主動免疫對SD 雄鼠下丘腦GnRH 合成及性腺反饋系統(tǒng)的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學報，2013，44(4):562-569.

［10］ 魏鎖成，鞏轉(zhuǎn)娣.GnRH-A 免疫對兔去勢效果的實驗研究［J］.畜牧獸醫(yī)學報，2009，40(2):191-196.

［11］ CLAUS R，LACORN M，DANOWSKI K，et al.Short-term endocrine and metabolic reactions before and after second immunization against GnRH in boars［J］.Vaccine，2007，25:4689-4696.

［12］ MELOEN R H，TURKSTRA J A，LANKHOF H，et al.Efficient immunocastration of male piglets by immunoneutralization of GnRH using a new GnRH-like peptide［J］.Vaccine，1994，12(8):741-746.

［13］ OLIVER W T，M CCAULEY I，HAR RELL R J，et al.A gonadotropin-releasing factor vaccine (Improvac)and porcine somatotropin have synergistic and additive effects on growth performance in group-housed boars and gilts［J］.Anim Sci，2003，81:1959-1966.

［14］ ZAMARATSKAIA G，ANDERSSON H K，CHEN G，et al.Effect of a gonadotropin-releasing hormone vaccine(ImprovacTM)on steroid hormones，boar taint compounds and performance in entire male pigs［J］.Reprod Dom Anim，2008，43:351-359.

［15］ ZAMARATSKAIA G，RYDHMER L，ANDERSSON H K，et al.Long-term effect of vaccination against gonadotropin-releasing hormone，using Improvac，on hormonal profile and behaviour of male pigs［J］.Animal Reprod Sci，2007，108(1-2):437-481.