殷 捷， 凌英會(huì)， 丁建平， 王麗娟， 張運(yùn)海， 章孝榮

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥230036;2.安徽省地方畜禽遺傳資源保護(hù)和生物育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230036)

磷酸酪氨酸互作結(jié)構(gòu)域1(Phosphotyrosine interaction domain containing 1，PID1)是通過(guò)抑制性消減雜交(Suppression subtractive hybridization，SSH)技術(shù)篩選的肥胖與正常人腹膜后脂肪組織中差異表達(dá)基因［1］。Wang 等［2］發(fā)現(xiàn)在肥胖與健康者腹膜后脂肪組織中PID1基因差異表達(dá)，且在肥胖者脂肪組織中顯著上調(diào)。PID1基因在脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)中起著重要的作用［3］，已有學(xué)者提出將PID1基因作為一個(gè)抑制胰島素而導(dǎo)致肥胖的作用靶位點(diǎn)［4］。PID1基因在脂肪細(xì)胞中過(guò)表達(dá)可顯著促進(jìn)3T3-L1 脂肪前體細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致脂肪細(xì)胞數(shù)目增多，進(jìn)而參與脂肪的發(fā)生發(fā)展［5］。反之，利用基因敲除手段下調(diào)PID1基因表達(dá)量后，脂肪細(xì)胞中胰島素敏感的葡萄糖大量攝取，促進(jìn)IRS-1/PI3K/AKT信號(hào)通路，降低葡萄糖的濃度［6］。而且PID1基因參與了多組織胰島素的敏感調(diào)節(jié)，脂肪細(xì)胞胰島素敏感性的高低與脂肪沉積密切相關(guān)［7］。PID1基因是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新基因，作為一種信號(hào)分子在細(xì)胞生長(zhǎng)和成脂過(guò)程中直接起作用，在脂肪組織中有PID1的高表達(dá)現(xiàn)象。錢(qián)源等將豬PID1基因作為重要生產(chǎn)性狀候選基因進(jìn)行研究，通過(guò)肌內(nèi)脂肪(IMF)含量測(cè)定與基因表達(dá)關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)PID1基因與脂肪沉積性狀存在一定的關(guān)系［8］。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證PID1基因?qū)?nèi)脂肪含量這一性狀的影響，篩選影響山羊生長(zhǎng)性狀的候選基因，本研究采用Real time-PCR 技術(shù)對(duì)山羊PID1基因的組織表達(dá)特點(diǎn)以及PID1基因在安徽白山羊不同組織脂肪組織中的表達(dá)水平和肌內(nèi)脂肪含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，從分子水平上揭示PID1基因與肌內(nèi)脂肪含量的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)樣品采自合肥博大牧業(yè)種羊場(chǎng)。選擇0 月齡(6 只)、6 月齡(8 只)和12 月齡(9 只)的安徽白山羊，統(tǒng)一飼養(yǎng)管理，飼喂等量日糧，自由飲水。禁食12 h 后頸靜脈放血屠宰。準(zhǔn)確稱(chēng)量胴體質(zhì)量后立即取屠體的心、肝、脾、肺、腎、小腸、脂肪、腿肌、背最長(zhǎng)肌和胸肌等10 個(gè)組織樣，標(biāo)記后放入液氮保存，后轉(zhuǎn)入實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱保存，用于PID1基因表達(dá)分析。另采集腿肌、背最長(zhǎng)肌和胸肌約30 g，置于-20 ℃保存，用于測(cè)定肌內(nèi)脂肪含量。

1.2 試劑和儀器

TIANpure Midi Plasmid Kit、Top10 感受態(tài)細(xì)胞、pMD18-T Simple Vector 為北京天根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;RNAiso Plus Total 、RNAPrimeScript RT reagent kit 為T(mén)aKaRa 公司產(chǎn)品;SYBR Premix 為羅氏公司產(chǎn)品;引物由華大基因公司合成;StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀為美國(guó)ABI 公司;低溫高速離心機(jī)(Centrifuge 5417R)為德國(guó)Eppendorf 公司產(chǎn)品;PCR 儀、凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)Bio-rad 公司產(chǎn)品。電泳儀為北京六一儀器廠產(chǎn)品。

1.3 肌內(nèi)脂肪(IMF)含量測(cè)定

取胸肌、腿肌和背最長(zhǎng)肌，去除可見(jiàn)脂肪，粉碎后采用索氏抽提法分別測(cè)定胸肌、腿肌和背最長(zhǎng)肌的肌內(nèi)脂肪含量。

1.4 PID1 基因表達(dá)分析

1.4.1 總RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄 取約100 mg 樣品，用TaKaRa 公司的RNAiso Plus Total RNA 試劑提取安徽白山羊各組織的總RNA，將提取到的總RNA 分裝。取2 μl 粗提總RNA 在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)完整性，利用分光光度計(jì)SMA1000 測(cè)定其濃度和純度，檢測(cè)合格的RNA 于-80 ℃中保存?zhèn)溆谩Ｌ崛〉目俁NA 按照TaKaRa 公司Prime-Script RT reagent kit 說(shuō)明書(shū)將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 RT-PCR 反應(yīng)與克隆測(cè)序 以cDNA 第一鏈為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，分別對(duì)反應(yīng)條件、循環(huán)數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化。PID1和GAPDH(3-磷酸甘油醛脫氫酶)基因的PCR 反應(yīng)體系均為50.00 μl，其中10 ×Ex Tapbuffer 5.00 μl，Ex TapHS 0.25 μl，dNTP mixture 4.00 μl，上下游引物(20 μmol/L)各1.00 μl，cDNA 模板(50 ng)1.00 μl，ddH2O 34.75 μl。PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，采用天根50 bp Marker 作為標(biāo)記。純化的DNA 片段與PMD-18T simple 載體連接，并轉(zhuǎn)化TOP10 感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布于固體培養(yǎng)基(33 g營(yíng)養(yǎng)瓊脂加入1 000 ml 蒸餾水，以1 000∶ 1 的比例加入Amp+)表面，37 ℃培養(yǎng)16 ～18 h 獲得重組子，挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，PCR 鑒定后送華大基因公司測(cè)序。

1.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 及熔解曲線分析 用實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x檢測(cè)肌肉組織中PID1mRNA 表達(dá)水平。反應(yīng)體系15.0 μl，包括1.5 μl cDNA，0.9 μl 上下游混合引物，7.5 μl SYBR Green mixture，5.1 μl ddH2O。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃5 s，60℃31 s，39 個(gè)循環(huán)。

1.5 安徽白山羊PID1 基因的組織表達(dá)特異性分析

以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因作為參照基因，SYBR GreenΙ 為熒光染料，采用RT-qPCR檢測(cè)安徽白山羊PID1基因在心、肝、脾、肺、腎、小腸、脂肪、腿肌、背最長(zhǎng)肌和胸肌10 個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量。以cDNA 為模板，用定量引物進(jìn)行檢測(cè)，其反應(yīng)體系(15.0 μl)為:1.5 μl cDNA，0.9 μl上下游混合引物，7.5 μl SYBR Green mixture，5.1 μl ddH2O。于ABI StepOne RT-PCR 反應(yīng)儀上進(jìn)行檢測(cè)，其反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃5 s，60 ℃31 s，39 個(gè)循環(huán)，60 ℃捕捉熒光值。每個(gè)組織重復(fù)檢測(cè)4 次。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析，其中ΔCt=CtPID1-CtGAPDH，ΔΔCt= ΔCt組織-ΔCt腿肌。

1.6 定量引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank 中已公布的山羊的PID1基因(JN257257)序列，采用premier5.0 軟件設(shè)計(jì)目的基因上下游引物。以持家基因GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)GenBank 中山羊GAPDH基因(AJ431207.1)序列設(shè)計(jì)引物(表1)。所有引物均由華大基因公司合成。

表1 目的基因引物序列Table 1 Primer sequence of the target genes

1.7 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)熔解曲線來(lái)判斷PCR 反應(yīng)的特異性，根據(jù)熒光定量PCR 的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線中的擴(kuò)增效率計(jì)算定量試驗(yàn)結(jié)果。所得結(jié)果采用MX3000p 定量軟件進(jìn)行分析。相對(duì)定量的結(jié)果采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各部分肌肉內(nèi)脂肪含量的比較

選取0 月齡組、6 月齡組和12 月齡組3 個(gè)生長(zhǎng)階段個(gè)體，屠宰后分別測(cè)定背最長(zhǎng)肌、腿肌和胸肌的肌內(nèi)脂肪(IMF)含量。隨著月齡的增加，山羊各部分肌肉肌內(nèi)脂肪含量的發(fā)育性變化模式基本一致，呈上升趨勢(shì)，且0 ～12 月齡背最長(zhǎng)肌IMF 含量均顯著高于腿肌和胸肌(表2)。

2.2 PID1 基因的時(shí)空表達(dá)譜分析

通過(guò)測(cè)序和Blast 比對(duì)發(fā)現(xiàn)，PID1和GAPDH基因的TR-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小與預(yù)期一致，同源性在99%以上，其中GAPDH基因同源性為100%。利用實(shí)時(shí)定量PCR 對(duì)心、肝、脾、肺、腎、小腸、脂肪、腿肌、背最長(zhǎng)肌和胸肌10 個(gè)組織中PID1基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。PID1基因在所有組織中均表達(dá)，其中在0 月齡肺、6 月齡小腸和脂肪、12 月齡脂肪組織中高度表達(dá)，在0 月齡肝、6 月齡肝、脾和肺及12 月齡的脾和肺部組織中度表達(dá)，在其余組織中相對(duì)低度表達(dá)。

表2 3 個(gè)組織的肌內(nèi)脂肪含量比較Table 2 The comparison of IMF content among three tissues

圖1 PID1 基因的相對(duì)表達(dá)譜Fig.1 The relative expression level of PID1 gene

由圖2 可見(jiàn)，隨著年齡的增加，肝臟中PID1表達(dá)量呈顯著直線下降趨勢(shì)(P＜0.05)，脾中PID1表達(dá)量逐漸上升，心PID1表達(dá)量先上升后下降，肺中PID1表達(dá)量先下降后上升;PID1在腎中一直為低表達(dá)，12 月齡時(shí)有稍微上升的趨勢(shì);腿肌、背最長(zhǎng)肌和胸肌中的PID1基因表達(dá)量均呈上升的趨勢(shì)。

圖2 各組織PID1 基因表達(dá)量的發(fā)育性變化Fig.2 The developmental changes of the expression level of PID1 in tissues

圖3 脂肪組織中PID1 表達(dá)量的發(fā)育性變化Fig.3 The developmental changes of the expression level of PID1 in the adipose

2.3 脂肪組織中PID1 基因表達(dá)水平分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)對(duì)各月齡組山羊PID1基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果(圖3)顯示各月齡組間脂肪組織PID1基因表達(dá)水平均差異顯著(P＜0.05)。

2.4 PID1 基因表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪含量的相關(guān)性

對(duì)山羊脂肪組織PID1基因mRNA 表達(dá)量及肌內(nèi)脂肪含量進(jìn)行簡(jiǎn)單線性相關(guān)分析，結(jié)果表明0 ～12 月齡期間PID1基因mRNA 表達(dá)量與背最長(zhǎng)肌IMF 含量呈顯著相關(guān)(r= 0.968，P＜0.05)，而PID1表達(dá)量與腿肌(r= 0.910)和胸肌(r= 0.879)IMF 含量間沒(méi)有顯著相關(guān)(P＞0.05)。

3 討論

大量遺傳學(xué)、藥理學(xué)和生理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，PID1在細(xì)胞生長(zhǎng)和成脂過(guò)程中起直接調(diào)節(jié)作用，對(duì)于嚙齒類(lèi)動(dòng)物的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)［9］。PID1基因有一個(gè)PTB(磷酸酪氨酸作用位點(diǎn))結(jié)構(gòu)域，與信號(hào)蛋白shc 上PTB 結(jié)構(gòu)域相似，參與生長(zhǎng)因子刺激下細(xì)胞增殖等下游效應(yīng)［10］。PTB 結(jié)構(gòu)域可參與低密度脂蛋白受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在哺乳動(dòng)物中首先作為一種失效(Dab-1)蛋白使小鼠mdabl基因自發(fā)常染色體隱形突變［11］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)PID1基因在3T3-L1 脂肪細(xì)胞中過(guò)表達(dá)能夠顯著下調(diào)脂肪細(xì)胞胰島素信號(hào)途徑中胞膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)的基因-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4(GLUT4)的表達(dá)［12］，明顯促進(jìn)3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞增殖，不影響脂肪細(xì)胞的分化過(guò)程［13］。同時(shí)張春梅［14］等的研究結(jié)果也證明，PID1基因過(guò)表達(dá)能抑制胰島素刺激直接影響脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取，并抑制葡糖的轉(zhuǎn)換，進(jìn)而影響機(jī)體的胰島素敏感性，導(dǎo)致脂肪組織的沉積。有研究結(jié)果表明，參與能量代謝的基因可能會(huì)影響家畜的重要經(jīng)濟(jì)性狀［15］。這一結(jié)論在陳哲等［16］、王興平［17］等的試驗(yàn)結(jié)果中得到印證。Xu 等［18］從天府山羊中克隆出PID1基因，獲得一段896 bp 的cDNA序列，PID1基因在天府山羊背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)隨著年齡的增長(zhǎng)而顯著增加。

本研究發(fā)現(xiàn)PID1基因在不同組織(如肺、小腸、脂肪組織、肝、脾)呈中度、高度表達(dá)，這與對(duì)豬的研究結(jié)果相符［19］。肝臟中PID1基因表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，而脂肪組織中PID1表達(dá)呈顯著增長(zhǎng)趨勢(shì)(P＜0.05)，這一結(jié)果可能與肝臟是機(jī)體脂肪代謝的重要器官相關(guān)［20］。如果能利用RNAi 等技術(shù)進(jìn)一步降低組織中PID1基因表達(dá)水平，或許能直接觀察到PID1的表型效應(yīng)。PID1基因在不同個(gè)體脂肪組織中表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果表明，隨著肌內(nèi)脂肪含量的增加，PID1的表達(dá)水平呈遞增趨勢(shì)，且各月齡組之間表達(dá)量差異顯著(P＜0.05)，這與其在成脂過(guò)程中的調(diào)節(jié)功能是相一致的。進(jìn)一步的相關(guān)分析結(jié)果表明，0 ～12 月齡期間PID1基因的表達(dá)量與背最長(zhǎng)肌肌內(nèi)脂肪含量呈顯著相關(guān)(r=0.968，P＜0.05)，與Xu 等［18］的結(jié)論一致;PID1基因表達(dá)量與0 ～12 月齡腿肌肌內(nèi)脂肪含量間的相關(guān)系數(shù)r=0.910，但未達(dá)到顯著水平;PID1基因表達(dá)量與0 ～12月齡胸肌肌內(nèi)脂肪含量間的相關(guān)系數(shù)r=0.879，也未達(dá)到顯著水平。以上結(jié)論說(shuō)明PID1基因的表達(dá)量與山羊脂肪沉積有關(guān)聯(lián)。PID1的表達(dá)對(duì)腿肌和胸肌IMF 沒(méi)有影響，但不足以說(shuō)明其只對(duì)山羊背最長(zhǎng)肌有影響，因?yàn)橥燃『托丶≈蠭MF 含量差異不顯著，這需要擴(kuò)大群體數(shù)量重新選擇樣本進(jìn)行研究。

本研究利用實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)對(duì)PID1基因在山羊不同體組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其在心、肝、脾、肺、腎、小腸、脂肪、腿肌、背最長(zhǎng)肌和胸肌中均有不同程度的表達(dá)。進(jìn)一步研究PID1基因在不同個(gè)體脂肪組織中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)PID1基因的表達(dá)量均與背最長(zhǎng)肌、腿肌和胸肌IMF 相關(guān)。進(jìn)一步證明了PID1基因可以作為影響山羊育肥性狀的重要分子遺傳標(biāo)記進(jìn)行研究，為優(yōu)質(zhì)肉羊的選育提供了理論依據(jù)。

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