許夢微， 張傳健， 周 希， 王志勝， 侯繼波， 王繼春

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院國家獸用生物制品工程技術研究中心，江蘇 南京210014;2.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇 南京210095;3.無錫市錫山區(qū)城區(qū)畜牧獸醫(yī)站，江蘇 無錫214101)

鴨瘟(Duck plague)是由鴨瘟病毒(Duck enteritis virus，DEV)引起的鴨、鵝和天鵝等水禽的一種急性傳染病，其特征是傳播迅速、發(fā)病率和死亡率高，嚴重威脅養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展［1］。鴨瘟的臨床特癥包括感染鴨精神萎頓、下痢、流淚等，部分病鴨出現(xiàn)頭頸部腫脹的特征性病癥，組織病變包括食道黏膜出血或潰瘍，泄殖腔黏膜出血與壞死，肝出血或有壞死灶等［2］。接種鴨瘟弱毒活疫苗或滅活疫苗可以產(chǎn)生有效保護。無論是自然感染還是人工感染的耐過鴨，均可獲得堅強的免疫力，能對強毒攻擊完全保護，且免疫保護的持續(xù)期可達數(shù)年［3-4］。

診斷鴨瘟的常用方法有病毒中和試驗(NT)、瓊脂糖凝膠沉淀試驗(AGP)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和聚合酶鏈式反應(PCR)等。NT 試驗通常作為抗體檢測和病毒鑒定的可靠方法，但存在操作復雜、周期長、敏感性低等問題［5］，不適用于基層和大量樣品檢測。AGP 是在瓊脂糖凝膠中進行的抗原抗體免疫沉淀反應，特點是簡便、特異性好、試驗條件要求低，既可定性又可定量，易于推廣，但敏感性不佳。ELISA 因其特異性和敏感性俱佳，且能檢測大量樣品而得到廣泛應用，既可檢測抗體，又可檢測抗原，但要求抗原純度較高。PCR 診斷技術作為一種新的檢測手段和方法，具有快速、敏感、特異性強、操作簡便等特點，被廣泛用于病原的診斷［6-9］。1998 年Plummer 等首先用PCR 方法檢測鴨瘟病毒DNA 獲得成功［10］。謝芝勛等根據(jù)己發(fā)表的DEV 基因序列設計PCR 引物擴增特異片段，可檢測到100 fg 的DEV DNA 模板［11］。但這些PCR 方法只能診斷是否是鴨瘟病毒，而無法鑒別鴨瘟病毒是強毒株還是弱毒株［12-14］，更無法區(qū)別不同來源的毒株。

江蘇省農(nóng)業(yè)科學院國家獸用生物制品工程技術研究中心(下文稱本實驗室)分離鑒定了一株鴨瘟病毒強毒株(LH2011)，對其LORF11 同源子序列測定結果表明其全長為4 341 bp (JX885588)，與中國的另一株強毒株CHv 株(JQ647509.1)一致，對比已發(fā)表的其他毒株的LORF11 同源子序列發(fā)現(xiàn)，歐洲株2085 株(JF999965)、Holland 株(JQ595417)、Jansen 株 (JQ430740.1 )和 D11-JW-016 株(JQ430739.1)為3 171 bp，中國疫苗株VAC 株為828 bp (EU082088.2)，而另一株中國疫苗株clone-03 株為2 412 bp(EU294364.1 )［15-16］。不同來源鴨瘟病毒毒株的LORF11 同源子表現(xiàn)明顯的多態(tài)性，能夠區(qū)別出毒株是強毒或弱毒，還能區(qū)別毒株的來源。本研究根據(jù)鴨瘟病毒LORF11 同源子的序列特點，設計特異性引物，建立用于鑒別鴨瘟病毒的PCR 方法。

1 材料與方法

1.1 毒株和菌株

鴨瘟病毒LH2011 株由本實驗室分離鑒定，半數(shù)致死量(LD50)為1 ml 10-2.3;鴨瘟病毒v2085 株由德國柏林自由大學獸醫(yī)學院病毒研究所提供，LD50為1 ml 10-1.6;鴨瘟病毒VAC 株和Clone-03 株來自南京天邦生物科技有限公司，半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)分別為1 ml 10-4.5、10-3.5。鴨坦布蘇病毒JS/2010 由由南京天邦生物科技有限公司提供;禽流感病毒CCTCC-V200312 購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心;鴨疫里默氏菌ATCC 11845 購自美國標準菌種收藏所;鴨沙門氏菌CMCC 50083 購自中國醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心;鴨大腸桿菌CVCC 83003、鴨病毒性肝炎病毒CVCC AR2111、番鴨細小病毒CVCC AV238、傳染性法氏囊病病毒CVCC AV140、雞新城疫病毒CVCC AV1615、巴氏桿菌CVCC 471 均購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 試驗鴨、雞胚及試劑

試驗鴨為鴨瘟抗體陰性的60 ～70 日齡健康鴨;9 日齡SPF 雞胚來自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司;Ex TaqDNA 聚合酶、RT-PCR 試劑和DNA Marker 購自大連TaKaRa 公司;蛋白酶K 購自哈爾濱寶泰克生物科技公司;DMEM 培養(yǎng)基和新生牛血清購自GIBCO 公司。

1.3 引物設計和基因測序

應用Invitrogen 軟件，參考已公開發(fā)表的全部鴨瘟病毒株LORF11 等位基因序列，在其上游5 bp 和下游101 bp 的位置設計1 對引物Primer F(5'-CATCTCGTGTCAGTTAAAGG-3')和 Primer R (5'-AAAACAAGAGTCAAGAGCCG-3')。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，用滅菌超純水將上游和下游引物均稀釋為10 pmol/ml，存放于-20 ℃。序列測定由華大基因科技服務有限公司完成。

1.4 鴨瘟病毒的增殖與病毒樣本的提取

分別取10 倍最小致死劑量的鴨瘟病毒LH2011株和v2085 株肌肉接種2 月齡健康非免鴨，待鴨只發(fā)病后，取鴨只的肝臟等約0.1 ～0.5 g，加入10 倍量無菌純水，研磨后，反復凍融3 次，8 000 r/min離心15 min，取上清作為組織提取物備用。鴨瘟病毒VAC 株和Clone-03 株分別按0.01 的感染復數(shù)感染雞胚成纖維細胞，當細胞病變(CPE)達60% ～70%時，將上清與細胞一起反復凍融3 次，8 000 r/min離心15 min，取上清作為組織提取物備用。同時設未感染鴨瘟病毒的雞胚成纖維細胞為對照，按與感染病毒的細胞相同的方法處理。參照《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》2000 版附錄所述方法分別測定鴨瘟病毒LH2011 株和v2085 株的LD50，以及VAC 株和Clone-03 株的TCID50。

1.5 鴨瘟病毒DNA 提取

取組織提取物制備的上清液445 μl，加入10%SDS 50 μl，20 mg/ml蛋白酶K2.5 μl，混勻，56 ℃水浴1 h，99 ℃水浴10 min，冷卻至室溫;用等體積的酚抽提2 次，等體積的酚∶ 氯仿(1∶ 1)抽提1 次，取上清液，加入1/10 體積的3 mol/L醋酸鈉(pH =5.2)和1 ～2 倍體積無水乙醇，上下顛倒混勻，置-20 ℃條件下40 min 至數(shù)天;4 ℃、12 000 r/min條件下離心20 min，棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌，置超凈臺中風干，加入20 ～100 μl 無菌純水溶解，作為病毒DNA 備用。

1.6 鴨瘟病毒各毒株的PCR 擴增

分別以各鴨瘟病毒毒株提取的病毒DNA 為模板，用特異性引物進行擴增。反應體系:10 × PCR Buffer 5.0 μl，dNTPs(2.5 mmol/L)4.0 μl，Mg2+(25 mmol/L)3.0 μl，上下游引物(10 pmol/μl)各2.0 μl，Ex Taq酶0.5 μl，DNA 模板2.0 μl，ddH2O 31.5 μl。反應條件:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸220 s，循環(huán)40 次;最后72 ℃延伸10 min。反應結束后取PCR 產(chǎn)物5 μl 與Marker 一起分別點入1% 瓊脂糖凝膠上，電泳40 min，在紫外燈照射下觀察擴增片段的長度。取PCR產(chǎn)物，回收后進行序列測定。

1.7 PCR 特異性試驗

將鴨瘟病毒LH2011 株、鴨瘟病毒v2085 株、鴨瘟病毒VAC 株、鴨瘟病毒Clone-03 株與鴨坦布蘇病毒JS/2010、禽流感病毒CCTCC-V200312、鴨疫里默氏菌ATCC 11845、鴨沙門氏菌CMCC 50083、鴨大腸桿菌 CVCC 83003、鴨病毒性肝炎病毒 CVCC AR2111、番鴨細小病毒CVCC AV238、傳染性法氏囊病病毒 CVCC AV140、雞新城疫病毒 CVCC AV1615、巴氏桿菌CVCC 471 等10 種病原體的DNA 或cDNA 分別按上述方法進行PCR 擴增。DNA 病毒和細菌按常規(guī)方法培養(yǎng)后，分別提取DNA作為模板，進行PCR 反應。RNA 病毒按照常規(guī)方法培養(yǎng)后，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，以cDNA為模板進行PCR 反應。

1.8 PCR 靈敏性試驗

分別取鴨瘟病毒各毒株的組織提取物用生理鹽水10 倍梯度稀釋，直到稀釋度為10-9。對每種病毒樣品組織提取物的各稀釋液提取病毒DNA，并進行PCR 擴增，以出現(xiàn)陽性反應條帶的模板用量的最高稀釋倍數(shù)計算可檢出最低病毒含量。

1.9 鴨組織樣品中鴨瘟病毒的檢測

分別取10 倍最小致死劑量的鴨瘟病毒LH2011株和v2085 株肌肉接種2 月齡健康非免鴨，待鴨只發(fā)病后，取鴨只的肝臟約0.1 ～0.5 g 作為組織樣品。鴨瘟病毒VAC 株和Clone-03 株分別按103TCID50的量肌肉接種2 月齡健康非免鴨，1 d 后，取鴨只的肝臟約0.1 ～0.5 g 作為組織樣品。分別在各組織樣品中加入10 倍量無菌純水，研磨后，反復凍融3 次，8 000 r/min離心15 min，取上清作為組織提取物用。同時設未感染鴨瘟病毒的鴨肝臟為對照，按感染病毒的樣品相同的方法處理得到健康鴨的組織提取物。

1.10 臨床病料的PCR 檢測

魏雪濤等［17］選擇鴨瘟病毒UL6、UL7 保守序列，設計了1 對特異性引物，建立了鴨瘟病毒快速鑒別診斷的PCR 方法。我們同時用本研究建立的PCR 方法和魏雪濤等建立的傳統(tǒng)PCR 方法對本實驗室保存的8 份疑似鴨瘟病毒感染的臨床組織病料進行檢測，同時設立已知的中國強毒株和中國疫苗株Clone-03 株作為陽性對照，正常鴨組織作為陰性對照。

2 結果

2.1 鴨瘟病毒的PCR 鑒定

將PCR 擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。以鴨瘟病毒LH2011 株為模板的PCR 擴增產(chǎn)物長度為4 430 ～4 460 bp;以鴨瘟病毒v2085 株為模板的PCR擴增產(chǎn)物長度為3 260 ～3 290 bp;以鴨瘟病毒VAC株為模板的PCR 擴增產(chǎn)物長度為920 ～950 bp;以鴨瘟病毒Clone-03 株為模板的PCR 擴增產(chǎn)物長度為2 510 ～2 540 bp(圖1)。將PCR 產(chǎn)物分別進行測序，發(fā)現(xiàn)其大小分別為4 448 bp、3 277 bp、934 bp 和2 518 bp，而且序列與發(fā)表的序列完全相符。

圖1 PCR 鑒別鴨瘟病毒毒株Fig.1 PCR identification of duck enteritis virus(DEV)strains

2.2 PCR 特異性試驗

如圖2 所示，以鴨瘟病毒LH2011 株為模板的PCR 產(chǎn)物為4 430 ～4 460 bp;以鴨瘟病毒v2085 株為模板的PCR 產(chǎn)物為3 260 ～3 290 bp;以鴨瘟病毒VAC 株為模板的PCR 產(chǎn)物為920 ～950 bp;以鴨瘟病毒Clone-03 株為模板的PCR 產(chǎn)物為2 510 ～2 540 bp;其他各樣品均無條帶。

圖2 鴨瘟病毒PCR 特異性試驗Fig.2 Specificity of PCR method for DEV detection

2.3 PCR 靈敏性試驗

以感染鴨瘟病毒LH2011 株的組織提取物稀釋105倍后提取的DNA 為模板，得到的PCR 產(chǎn)物電泳后出現(xiàn)大小為4 430 ～4 460 bp 的特異性條帶。該病毒樣品組織提取物的LD50為1 ml 10-2.3，所以此方法可以檢測到0.1LD50的鴨瘟病毒LH2011 株。以感染鴨瘟病毒VAC 株的組織提取物稀釋107倍后提取的DNA 為模板，得到的PCR 產(chǎn)物電泳后出現(xiàn)920 ～950 bp 特異性條帶。該病毒樣品組織提取物的TCID50為1 ml 10-6.5，所以此方法可以檢測到10TCID50的鴨瘟病毒VAC 株。以感染鴨瘟病毒Clone-03 的組織提取物稀釋106倍后提取的DNA 為模板，得到的PCR 產(chǎn)物電泳后出現(xiàn)2 510 ～2 540 bp 特異性條帶。該病毒樣品組織提取物的TCID50為1 ml 10-5.5，所以此方法可以檢測到10TCID50的鴨瘟病毒Clone-03 株。以感染鴨瘟病毒v2085 株的組織提取物稀釋104倍后提取的DNA 為模板，得到的PCR產(chǎn)物電泳后出現(xiàn)3 260 ～3 290 bp 特異性條帶。該病毒樣品組織提取物的LD50為1 ml 10-1.6，所以此方法可以檢測到0.1LD50的鴨瘟病毒v2085 株。

2.4 鴨組織樣品中鴨瘟病毒的檢測

如圖3 所示，以鴨瘟病毒v2085 株感染鴨肝臟樣品為模板的PCR 條帶為3 260 ～3 290 bp;以鴨瘟病毒LH2011 株感染鴨肝臟樣品為模板的PCR 條帶為4 430 ～4 460 bp;以鴨瘟病毒VAC 株感染鴨肝臟樣品為模板的PCR 條帶為920 ～950 bp;以鴨瘟病毒Clone-03 株感染鴨肝臟樣品為模板的PCR 條帶為2 510 ～2 540 bp;以未接種的健康鴨肝臟樣品為模板的無條帶。

圖3 感染鴨瘟病毒鴨組織樣本檢測結果電泳圖Fig.3 The PCR detection of duck tissues infected with DEV

2.5 臨床病料的PCR 檢測

用本研究建立的PCR 法檢測臨床病料，結果(圖4)顯示1、2、4、7、8 號臨床組織病料擴增出了4 448 bp 左右的條帶，鴨瘟病毒LH2011 株(中國強毒株)擴增出4 448 bp 左右的條帶，鴨瘟病毒Clone-03 株(中國疫苗株)擴增出2 518 bp 左右的條帶，正常鴨組織未擴增出條帶。確定1、2、4、7、8 號臨床組織病料為鴨瘟病毒中國強毒株感染。傳統(tǒng)PCR 檢測結果如圖5 所示，1、2、4、7、8 號臨床組織病料、鴨瘟病毒LH2011 株(中國強毒株)及鴨瘟病毒Clone-03 株(中國疫苗株)均擴增出1 293 bp 左右的條帶，正常鴨組織未擴增出條帶。傳統(tǒng)的PCR 方法只能檢測臨床樣品是否感染了鴨瘟病毒，而本研究建立的PCR 方法不僅能檢測臨床樣品是否感染了鴨瘟病毒，且能鑒別該鴨瘟病毒的來源。

圖4 本研究建立的PCR 方法檢測臨床病料結果Fig.4 Detection of clinical samples by PCR established in this study

圖5 傳統(tǒng)PCR 方法檢測臨床病料結果Fig.5 Detection of clinical samples by conventional PCR

3 討論

本研究中對比分析了已發(fā)表的鴨瘟病毒歐洲強毒株、中國強毒株及中國弱毒株的LORF11 等位基因序列，發(fā)現(xiàn)鴨瘟病毒歐洲強毒株LORF11 等位基因的開放閱讀框(ORF)為3 171 bp，鴨瘟病毒中國強毒株的LORF11 等位基因序列中則發(fā)生了基因片段的插入，使其等位核苷酸序列變?yōu)? 342 bp，鴨瘟病毒VAC 株(中國疫苗株)的LORF11 等位基因大小為828 bp，鴨瘟病毒Clone-03(中國疫苗株)的LORF11 等位基因大小為2 412 bp?？梢娖涠鄳B(tài)性顯著，且因來源不同和毒株不同而有明顯的特征，據(jù)此推斷可以根據(jù)LORF11 等位基因設計引物，來鑒別樣品是否感染了鴨瘟病毒，且應能鑒別該鴨瘟病毒是歐洲強毒株、中國強毒株、中國疫苗株(弱毒株)VAC 株還是中國疫苗株(弱毒株)Clone-03 株。試驗結果表明，本研究設計的引物(Primer F 和Primer R)對鴨瘟病毒強毒株和弱毒株均能擴增出與預計大小相符合的特異條帶，與推測的結果一致，序列測定的結果進一步驗證了此PCR 方法的可靠性。

本試驗中選取了雞新城疫病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、禽流感病毒以及鴨病毒性肝炎病毒、番鴨細小病毒、鴨坦布蘇病毒、鴨巴氏桿菌、鴨大腸桿菌、鴨沙門氏菌和鴨疫里默氏桿菌等鴨的主要細菌性和病毒性傳染病病原作為對照，結果表明，本研究設計的引物(Primer F 和Primer R)對鴨瘟病毒強毒株和弱毒株均能擴增出與預計大小相符合的特異條帶，而對其他10 種對照禽病病原體卻擴增不出任何條帶。這說明本研究建立的PCR 方法對于鴨瘟病毒的檢測擴增是特異的，為鑒別與鴨瘟臨床癥狀和病理變化相似的傳染病提供了一種診斷技術。

本研究建立的PCR 方法能檢測到10TCID50或0.1LD50的鴨瘟病毒DNA 含量，與賀東生等［18］建立的光敏生物素標記鴨瘟病毒核酸探針方法相比較，靈敏度提高至少10 倍。經(jīng)對鴨組織樣品中鴨瘟病毒的PCR 檢測，結果均擴增出特異性條帶。對疑似鴨瘟的臨床病料檢測也證實本PCR 方法具有快速、靈敏、特異的特點。如果再對PCR 產(chǎn)物進行測序，可以作為鴨瘟病毒診斷的一種標準方法。

LORF11 在強、弱毒株之間的差異可能與病毒的致病力變化密切相關，值得進一步研究。對于弱毒株中LORF11 所缺失的堿基對應的蛋白質(zhì)片段，應可以作為血清學診斷的靶標，這樣就可以與抗原診斷的PCR 方法配合起來，更加便于臨床上的鑒別診斷。

［1］ MONTGOMERY R，STEIN G J.An outbreak of duck virus enteritis (duck plague)in a captive flock of mixed waterfowl［J］.Avian Dis，1981，25(1):207-213.

［2］ 李金華，張馨月.鴨病毒性腸炎病毒(DEV)的主要特點及防制措施［J］.浙江畜牧獸醫(yī)，2007(6):10-11.

［3］ 程安春，汪銘書，劉 菲，等.PCR 在鴨瘟臨床診斷和免疫及致病機理研究中的初步應用［J］.病毒學報，2004，20(4):364-370.

［4］ LIU J，CHEN P，JIANG Y，et al.A duck enteritis virus-vectored bivalent live vaccine provides fast and complete protection against h5n1 avian influenza virus infection in ducks［J］.J Virol，2011，85(21):10989-10998.

［5］ 許宗麗，謝芝勛，謝麗基，等.鴨源新城疫病毒、鴨瘟病毒和鴨圓環(huán)病毒三重PCR 檢測方法的建立［J］.動物醫(yī)學進展，2013，34(4):23-26.

［6］ PRITCHARD L I，MORRISSY C，VAN PHUC K，et al.Development of a polymerase chain reaction to detect Vietnamese isolates of duck virus enteritis［J］.Veterinary Microbiology，1999，68:149-156.

［7］ 迪芬巴赫C W，德維克斯勒G S.PCR 技術實驗指南［M］.黃培堂，譯.北京:科學出版社，1998.

［8］ 彭秀玲，袁漢英.基因工程實驗技術［M］.2 版.長沙:湖南科學技術出版社，1997.

［9］ ZHAO L C，CHENG A C，WANG M S，et al.Identification and characterization of duck enteritis virus dUTPase gene［J］.Avian Dis，2008，52(2):324-331.

［10］ PLUMMER P J，ALEFANTIS T，KAPLAN S，et al.Detection of duck enteritis virus by polymerase chain reaction［J］.Avian Dis，1998，42:554-564.

［11］ 謝芝勛，謝志勤，劉加波，等.用聚合酶鏈反應檢測鴨瘟病毒的研究［J］.中國獸藥雜志，2000，34(4):10-12.

［12］ 韓先杰，王君偉，布日額，等.PCR 檢測鴨瘟病毒的研究［J］.中國獸醫(yī)科技，2003，33(8):10-14.

［13］ PLUMMER P J，ALEFANTIS T，KAPLAN S，et al.Deteion of duck enteritis virus by polymerase chain reaction［J］.Avian Diseases，1998，42:554-564.

［14］ HANSENW R，NASHOLD S W，BEOWN S E，et al.Diagnosis of duck plague in waterfowl by polymerase chain reaction［J］.Avian Dis，2000，44(2):266-274.

［15］ LI Y，HUANG B.Molecular characterization of the genome of duck enteritis virus［J］.Virology，2009，391(2):151-161.

［16］ WANG J，H?PER D.Complete genome sequence of virulent duck enteritis virus(DEV)strain 2085 and comparison with genome sequences of virulent and attenuated DEV strains［J］.Virus Res，2011，160(1-2):316-325.

［17］ 魏雪濤，張曉勇，李 銀，等.鴨瘟病毒PCR 檢測方法的建立［J］.浙江農(nóng)業(yè)學報，2010，22(6):750-753.

［18］ 賀東生，趙善昌.光敏生物素標記鴨瘟病毒核酸探針的制備及應用的研究［J］.廣西農(nóng)業(yè)大學學報，1993，12(3):69-74.