王 楠，韓 巖，劉虎仙，陳 淼

(解放軍總醫(yī)院整形修復科，北京 100853)

在當今醫(yī)療領(lǐng)域，腎臟、肝臟、心臟的器官移植技術(shù)日臻完善，在圍手術(shù)期器官保存方面積累了很多經(jīng)驗。而對于整形修復外科涉及的斷肢斷指再植的術(shù)前保護，還停留在一個比較低的水平，缺乏與之相匹配的器官保護液。本次實驗研究擬通過動物實驗，對國內(nèi)外常用的幾種器官保護液在大鼠離斷肢體模型中所發(fā)揮的作用進行對比，探討離斷肢體再植前是否需要對肢體行灌注處理，找出適用于離斷肢體灌注保護的器官保護液，優(yōu)化灌注效果，提高肢體再植的成功率。報告如下。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

10%水合氯醛溶液，0.9%氯化鈉注射液，ViaSpan(BELZER UW)器官冷藏液(Bristol Myers Squibb B.V. 生產(chǎn))，CUSTODIOL HTK 溶液(FRANZ KOEHLER CHEMIE GMBH 生產(chǎn))，乳酸鈉林格注射液，肝素鈉注射液，地塞米松磷酸鈉注射液，Dulbecco's Modified Eagle Medium 細胞培養(yǎng)液(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))，中性福爾馬林溶液，蘇木精粉劑(上?；瘜W試劑公司進口分裝)，伊紅粉劑(北京化工廠產(chǎn)品)。生物組織自動脫水機(8T-12K 亞光醫(yī)用電子技術(shù)研究所)，病理組織包埋機(BM-1 安徽省電子科學研究所)，切片漂烘溫控儀(QP-B2 安徽省電子科學研究所)，光學顯微鏡(ICC50 LEICA，德國)，工作站計算機(Z470 聯(lián)想，中國)，全自動生化分析儀(7170 HITACHI，日本)。

1.2 大鼠離斷肢體缺血模型的制備

健康成年Wistar 大鼠(雄性)40 只(體重在300 ～400g，由解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院實驗動物中心提供)。隨機分為4 組。用10%水合氯醛溶液1.5mL 腹腔注射麻醉。約5 分鐘麻醉生效后雙下肢、腹部及背部剃毛，將大鼠置于實驗臺上，固定四肢。在雙側(cè)腹股溝處設計弧性手術(shù)切口。沿標記線切開大鼠皮膚，分離皮下脂肪組織，分離出大鼠股動脈、股靜脈及股神經(jīng)，術(shù)中結(jié)扎并離斷同側(cè)旋髂動靜脈及陰部動靜脈，在骶尾部行銳性分離，在股骨頭處離斷髖關(guān)節(jié)，使股動靜脈得到最大限度的暴露。通過(0，7 ×19mm)一次性使用靜脈留置針對股動脈進行穿刺，插管成功后，綁管線固定牢靠。向股動脈灌注肝素鹽水，行抗凝保護。同理對股靜脈穿刺插管后，結(jié)扎股動、靜脈。對側(cè)肢體行相同處理后，沿標記線完整離斷雙側(cè)下肢，將大鼠下肢皮膚由遠端至近端連續(xù)對位縫合，包裹骨骼肌肉組織，減少暴露面積，避免過度蒸發(fā)。

1.3 大鼠離斷肢體缺血模型的實驗處理

A 組每只大鼠離斷下肢行UW 液灌注;B 組每只大鼠離斷下肢行HTK 液灌注;C 組每只大鼠離斷下肢行林格氏液+地塞米松+低分子肝素鈉灌注;D 組每只大鼠離斷下肢作為對照組，單純行生理鹽水灌注，灌注液自股動脈灌入，使用輸液泵控制滴速及灌注壓，排除肢體過度腫脹及遠端灌注不足的影響。將滴速設置為12mL/小時，連續(xù)灌注24 小時，灌注全程在4℃冰箱內(nèi)進行。

1.4 標本取材

自大鼠雙下肢離斷起計時，在第4h、8h、12h、16h、20h、24h 時間點取1mL 灌出液進行生化指標檢測。在第12h、24h 時間點取肢體標本做病理切片。

1.5 觀察指標

1.5.1 大鼠肌肉、血管組織結(jié)構(gòu)病理變化

將大鼠離斷下肢固定于木板上，于膝關(guān)節(jié)上1cm 處取同時包含動靜脈的肌肉組織塊(1cm* 1cm* 1cm)，依次編號。將編號的組織塊用10%福爾馬林固定48h，再置于90%、95%乙醇各12h，用無水乙醇脫水2 次(每次12h)，二甲苯透明2 次(每次12h)，以上操作均在常溫中進行。之后，于60℃浸蠟。浸蠟過程中使組織塊平展，標本應完全浸泡在浸泡液內(nèi)。將石蠟包埋好的組織塊置于滑動式切片機上切片，切片厚度為5um，依次編號，標記好順序。于45℃恒溫水浴箱中展片，撈至常規(guī)大小的載玻片上，所有切片行蘇木素-伊紅(HE)常規(guī)染色。在光鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)變化。

1.5.2 大鼠離斷肢體灌出液ALP、ALT、GLU 的生化指標檢測

按相應時間點，采用不同灌注液對大鼠離斷肢體進行灌注，在股靜脈插管處收集灌出液，依次編號，標記好灌注時間及灌注液種類，保存于–20℃冰箱中，待送臨床試驗檢測中心生化室，置于日立7170 型全自動生化分析儀中，進行ALP、ALT、GLU生化指標檢測。

1.6 統(tǒng)計學處理

使用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件對得數(shù)據(jù)整理，進行方差分析，結(jié)果使用均數(shù)±標準差表示，取α =0.05為檢驗水準，P ＜0.05 為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 在光鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)病理變化(附表1)

附表1 光鏡觀察組織結(jié)構(gòu)比較

圖1

圖2

圖3

圖4

圖5

圖6

2.1 相關(guān)生化指標的檢測結(jié)果(附表2、附表3、附表4)

附表2 組織中ALP 含量的變化分析

附表3 組織中ALT 含量的變化分析

附表4 組織中GLU 含量的變化分析

通過統(tǒng)計學分析，對比四組數(shù)據(jù)，可以發(fā)現(xiàn)A、B、C 組與作為對照組的D 組存在顯著性差異(P ﹤0.01)，即使用UW 液、HTK 液及林格氏液+地塞米松+低分子肝素鈉灌注液對大鼠離斷肢體進行灌注與單純使用生理鹽水灌注組相比較，在相同時間條件下ALT、ALP 升高緩慢，而GLU 含量降低緩慢。A、B、C 組間相比較無統(tǒng)計學差異(P ﹥0.05)。隨灌注時間延長，各組灌出液中ALP、ALT 均出現(xiàn)進行性增高，其中D 組升高幅度明顯高于其余三組。隨灌注時間延長，各組離斷肢體灌出液中GLU 含量逐漸降低，其中D 組降低幅度同樣明顯高于其余三組。A、B、C 組之間三項生化指標變化無統(tǒng)計學差異。

3 討論

在現(xiàn)代戰(zhàn)爭中，隨著大規(guī)模殺傷性武器的不斷出現(xiàn)，槍彈傷、爆炸傷的比重明顯增加，發(fā)生肢體離斷、損毀的情況在野戰(zhàn)外科工作中十分常見，英國醫(yī)學雜志《柳葉刀》調(diào)查報告顯示，在伊拉克戰(zhàn)場因四肢損傷而致殘的人數(shù)占到傷殘總數(shù)的20%，而到利比亞內(nèi)戰(zhàn)時期，這一比例則上升到40%［1］。受制于戰(zhàn)場特殊因素所限，很多傷員無法得到及時有效的治療，最終導致肢體外觀的畸形及功能的喪失，對部隊后續(xù)戰(zhàn)斗力的回復和傷員今后的生活質(zhì)量、心理健康造成了嚴重的影響。早在上世紀60年代，隨著顯微外科的發(fā)展，斷指、斷肢再植就成為了可能，整形外科和顯微外科的醫(yī)生在肢體功能重建領(lǐng)域取得了一系列引人矚目的成就，各種新技術(shù)、新方法、新材料不斷應用于臨床。但在戰(zhàn)時，四肢損傷致殘率卻一直居高不下，說明在戰(zhàn)場開展斷肢再植手術(shù)還存在很多問題。真正成功的肢體移植，不僅是要肢體成活，更重要的是功能恢復，這都與對離斷肢體的保護有直接關(guān)系。但戰(zhàn)地醫(yī)院普遍設立在距離一線戰(zhàn)場較遠的后方，后送轉(zhuǎn)運時間較長，在這期間如何對離斷肢體進行保存，是否需要像肝腎移植一樣對肢體進行灌注保護，由于沒有專門用于肢體灌注的液體，加之肢體與肝腎等實質(zhì)器官存在解剖學差異，使用哪種灌注液才能達到更好的保護效果，提高肢體再植的成功率及相關(guān)功能的恢復，這些問題都有待進一步研究。

在當今醫(yī)療領(lǐng)域，腎臟、肝臟、心臟的器官移植技術(shù)日臻完善，已廣泛應用于臨床，在圍手術(shù)期器官保存、術(shù)后預防缺血再灌注損傷，抗免疫排斥反應等方面也積累了很多寶貴的經(jīng)驗。其中在腎臟移植前采用UW 液灌注，心臟移植前采用HTK 液灌注已在國際上達成共識，可以起到很好的器官保護功能，根據(jù)各器官組織對缺氧缺血耐受的不同，有效的組織灌注通?？梢员４婺I臟72 小時，肝臟近30 小時，心臟24 小時［2］。而對于整形修復外科涉及的斷肢斷指再植的術(shù)前保護，還停留在一個比較低的水平，一般認為在常溫下缺血不超過6 ～7 小時，離斷肢體基本上可以再植成活。超過10 ～12 小時，成活率則顯著降低。保存方式視運送距離而定，如受傷地點距醫(yī)院較近，可將離斷肢體用無菌敷料或清潔布類包好，不做特殊處理。如遠距離運送，則應采用干燥冷藏法保存，將斷肢用無菌或清潔敷料包好，放入塑料袋中再放在加蓋的容器內(nèi)，外周加冰塊保存，避免斷肢與冰塊直接接觸，也不使用其他液體浸泡，也沒有與之相匹配的器官保護液出現(xiàn)［3］。研究表明，一種有效的器官保護液需要具備以下幾種保護效果:1.減輕低溫條件下易出現(xiàn)的細胞水腫;2. 可以預防細胞的酸化作用，減少酸性物質(zhì)堆積;3. 使細胞內(nèi)環(huán)境保持穩(wěn)定，減少正負離子跨細胞遷移;4. 減少缺血再灌注損傷，抑制氧自由基破壞作用;5. 提高細胞氧化磷酸化水平，增加糖代謝水平［4］。國外學者對UW 液及HTK 液的實驗研究已十分透徹，充分肯定了兩種器官保護液在抑制低溫水腫、細胞損傷方面的作用，臨床試驗結(jié)果表明:UW 液、HTK 液均可明顯延長組織器官對低溫缺血的耐受，可以使器官功能的損害從33%分別下降到23%和28%。證明UW 液對腎臟、肝臟、HTK 液對心臟具有良好的保護效果［5］。但也有研究報道提到器官保護液的高鉀高鈉離子對血管內(nèi)皮存在一定程度的損害。同時UW 液粘滯性很高，也可對臟器細胞及血管內(nèi)皮細胞造成不同程度的損害［6］。另一方面UW 液與HTK 液均無法國產(chǎn)，只能通過國內(nèi)代理商引入中國市場，這就間接導致兩種器官保護液價格十分昂貴，單純的術(shù)前器官保護性灌注就需要花費上萬元，給患者及家屬造成巨大的經(jīng)濟負擔。本實驗中涉及的自配灌注液在南方醫(yī)科大學附屬醫(yī)院等單位均成功應用于臨床，并證實有效［7］。

本次實驗研究通過動物實驗，對國內(nèi)外常用的幾種器官保護液在大鼠離斷肢體模型中所發(fā)揮的保護作用進行比較，論證離斷肢體再植前是否需要對肢體行灌注保護，找出適用于離斷肢體灌注保護的器官保護液，優(yōu)化灌注效果，提高肢體再植的成功率。

實驗中所采納比較的生化指標的意義:谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、葡萄糖(GLU)。正常狀態(tài)下，大鼠下肢骨骼肌細胞內(nèi)含有大量的堿性磷酸酶(ALP)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)。當離斷肢體后，骨骼肌細胞因缺血致肌細胞損傷，細胞膜發(fā)生破裂，大量的生物活性酶類釋放入血，故可以通過測定ALP、ALT 酶的數(shù)量變化來判定離斷肢體肌細胞缺血損傷的程度。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)主要在肌細胞內(nèi)含量較高，隨著缺血時間延長，其數(shù)值變化具備一定的規(guī)律性。國外研究發(fā)現(xiàn)，缺血損傷發(fā)生早期，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)隨時間延長呈直線上升趨勢，到達峰值后逐步回落。而堿性磷酸酶(ALP)與ALT 不同，主要分布于毛細血管內(nèi)皮細胞的基底膜，同時其在細胞肌膜上均勻分布著呈線性排列的酶顆粒。研究表明ALP 的變化規(guī)律與谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)大致相同，都是先上升后下降，最后隨著缺血時間的進一步延長最終消失［8］。葡萄糖(GLU)是肌體糖代謝的重要物質(zhì)，也是主要的供能物質(zhì)。當離斷下肢開始發(fā)生缺血損傷時，肌體正常的有氧氧化途徑障礙，直接供能物質(zhì)ATP 產(chǎn)量迅速下降，大量肌酸磷酸在轉(zhuǎn)化為ATP 供能的同時，糖酵解途徑單方面加強，使得GLU 含量顯著下降［9］。

大鼠離斷肢體缺血模型建立后不同時間組織的變化的意義。實驗表明，在同樣缺血的條件下，隨著缺血再灌注時間的延長，組織的損傷情況越重，即再灌注損傷的嚴重程度與時間成正比，而在行肢體再植術(shù)前，對離斷肢體進行灌注處理，可以有效的減輕水腫，減少氧自由基等有害成分的生成，達到增強肢體和相關(guān)機體抵抗再植及再灌注損傷的能力，使組織功能得到最大限度的保存，為提高肢體再植手術(shù)成功率提供一定的基礎(chǔ)。離斷肢體的損傷自離斷起同步發(fā)生，組織細胞由于缺血發(fā)生細胞水腫，滲透壓也隨之發(fā)生改變，隨著時間的推移，氧自由基等有害物質(zhì)產(chǎn)生增多，導致缺血再灌注損傷的發(fā)生。因此在離斷之初就進行離斷肢體灌注保護是十分必要的。通過實驗可以發(fā)現(xiàn)即使采用灌注保護，再植的最佳手術(shù)時間是在離斷12 小時內(nèi)，臨床上也通常是采用12 小時以內(nèi)作為手術(shù)的最佳時機［10］。

光鏡下組織大體結(jié)構(gòu)的變化情況，光學顯微鏡可以觀察組織細胞的大體形態(tài)，從本部分實驗病理結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，各組隨著時間的延長，組織損傷情況逐漸加重。而各灌注組與對照組相比較，在相同時間點損傷程度較輕，病理變化較小。各對照組之間進行比較可發(fā)現(xiàn)UW 液灌注組損傷程度明顯輕于其他三種灌注保護液。說明對離斷肢體行灌注處理具有細胞保護作用，其中UW 液保護效果最佳，但隨著時間推移，即便使用灌注液進行保護處理，組織損傷仍會不可避免的發(fā)生、加重。因此應謹慎選擇肢體再植時間，避免出現(xiàn)累及全身的病理變化。

灌注保存時需要注意的問題。臨床資料表明:影響再植肢體功能恢復，造成組織損傷的主要原因是由缺血損傷及血液再通后的再灌注損傷共同組成。而其中的關(guān)鍵在于減少肢體缺血時間，在行灌注液灌注保護前盡可能縮短機體缺血時間，盡快通血，才能有效的減低缺血損傷及再灌注損傷［11］。同時使用灌注液進行灌注保護可以有效的稀釋毒性代謝產(chǎn)物，減輕組織損傷。在灌注過程中合理設定灌注壓力，通常情況下應低于正常組織血流速度，避免因壓力過大對組織造成機械性損傷，因為離斷肢體極易發(fā)生細胞水腫，導致細胞脆性增加，對損傷的耐受程度減低。整個灌注過程在低溫下進行(4℃)，在低溫條件下，離斷肢體溫度降低可以有效的減少無氧代謝，使因為無氧代謝產(chǎn)生的自由基等有害物質(zhì)減少，同時也可以在一定程度上減輕炎癥反應。

結(jié)合光鏡、電鏡分別觀察各組間離斷肢體肌肉組織的大體損傷情況以及提取的生化指標可以發(fā)現(xiàn):三種灌注液UW 液、HTK 液及林格氏液+地塞米松+低分子肝素鈉混合灌注液均可以對離斷肢體起到保護作用，延長細胞活性時間，且在對肢體保護作用上要強于使用生理鹽水空白灌注。其中UW 液對離斷肢體的保護作用明顯強于其他兩種灌注液，HTK 液與林格氏液+地塞米松+低分子肝素鈉混合灌注液在對組織保護的作用上差異不大。

［1］Mowlavi A，Neumeister MW，Wilhelmi BJ，et al. Local hypothermia during early reperfusion protects skeletal muscle from hemia-reperfusion injury［J］. Plast econstr Surg，2003，111(1):243-251.

［2］Wilson YT，Lepore DA，Riccio M，et al. Mild hypothermia ptotects against ischaemia-reperfusion injury in rabbit skeletal muscle［J］. Br J Plast Surg，2007，50(5):343-349.

［3］夏穗生. 臨床移植醫(yī)學［M］. 杭州:浙江科學技術(shù)出版社，1999.95

［4］Lancerotto L，Tocco I，Salmaso R，Vindigni V，Bassetto F.Necrotizing fasciitis:classification，diagnosis，and management［J］.The journal of trauma and acute care surgery，2012，72(3):560-566.

［5］Edlich RF，Cross CL，Dahlstrom JJ，Long WB，3rd. Modern concepts of the diagnosis and treatment of necrotizing fasciitis［J］. J Emerg Med，2010，39(2):261-265.

［6］Dufel S，Martino M. Simple cellulitis or a more serious infection?［J］J Fam Pract，2006，55(5):396-400.

［7］趙聞雨，曾力，朱有.器官保存技術(shù)新進展［J］. 中華移植雜志(電子版)，2011，3(5):233-236.

［8］Takei S，Arora YK，Walker SM. Intravenous immunoglobulin contains specific antibodies inhibitory to activation of T cells by staphylococcal toxin superantigens［see comment］［J］. J Clin Invest，1993，91(2):602-607.

［9］Anaya DA，Bulger EM，Kwon YS，Kao LS，Evans H，Nathens AB. Predicting death in necrotizing soft tissue infections:a clinical score［J］. Surg Infect(Larchmt.)，2009，10(6):517-522.

［10］李繼峰，顧玉東，俞彰，等. 超氧化物歧化酶灌注對大鼠離體血管平滑肌組織結(jié)構(gòu)影響［J］. 復旦學報(醫(yī)學版)，2004，31(1):66-69.

［11］高宏，臧旺福，田海，等. 低溫氧合血微流量持續(xù)灌注保存大鼠心臟的效果［J］. 中華器官移植雜志，2007，28(9):537-540.