趙慧，王愛芝，王永生

(南華大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421001)

研究表明，腫瘤細(xì)胞的快速增殖可導(dǎo)致腺嘌呤核苷酸降解，使腺苷的產(chǎn)生和排出增多，尿中腺苷可以作為潛在的腫瘤標(biāo)志物［1-2］。因此，檢測(cè)尿液中腺苷含量對(duì)惡性腫瘤早期診斷、預(yù)后監(jiān)測(cè)等方面具有重要意義。

目前測(cè)定尿中痕量腺苷的方法有高效液相色譜法［3］、毛細(xì)管電泳法［4］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［5］、共振光散射法［6］、熒光分光光度法［7］等，這些方法雖然各有優(yōu)點(diǎn)，但都存在或多或少的不足。

本文基于腺苷與未標(biāo)記的腺苷適體特異性結(jié)合，金納米不被腺苷適體保護(hù)而在高鹽濃度下聚集，導(dǎo)致共振光散射增強(qiáng)的原理，建立RLS 測(cè)定腺苷的新方法，已用于尿樣中腺苷的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

腺苷、氯金酸、檸檬酸三鈉、氯化鈉等均為分析純;腺苷適體為色譜純(序列號(hào)為5'-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3'，臨用前需95 ℃5 min處理后，緩慢冷卻至室溫);實(shí)驗(yàn)用水為滅菌雙蒸水;金納米，按參考文獻(xiàn)［8］制備。

F-4500 熒光分光光度計(jì);UV-2550 紫外-可見分光光度計(jì);AB204-S 電子分析天平;PB-21 型精密酸度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

于2 mL EP 管中依次加入pH 4.6 BR 緩沖溶液35 μL，1.0 μmol/L 腺苷適體20 μL 和不同體積的1.0 ×10－10mol/L 腺苷溶液，漩渦混勻，于37 ℃恒溫水浴箱中孵育30 min。加入金納米粒子40 μL，加入適量滅菌雙蒸水，混勻，室溫孵育25 min。加入0.5 mol/L NaCl 溶液50 μL，混勻后立即在熒光分光光度計(jì)上以λex=λem進(jìn)行同步掃描，獲取RLS 光譜，記錄λmax=540 nm 處溶液RLS 強(qiáng)度(I)和試劑空白R(shí)LS 強(qiáng)度(I0)，計(jì)算ΔI=I－I0。激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為5.0，10.0 nm，光電倍增管電壓為400 V。同時(shí)在紫外-可見分光光度計(jì)上掃描吸收光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 光譜特征

圖1 為適體-AuNPs-腺苷體系的吸收光譜圖和RLS 圖譜。

圖1 適體-AuNPs-腺苷體系的吸收光譜(1)和RLS 光譜(2)Fig.1 Absorption and RLS spectra of aptamer-AuNPs-adenosine system

由圖1 可知，適體-AuNPs-腺苷體系的最大RLS峰位于540 nm，處于體系的最大吸收峰附近。由于RLS 作用包括散射-吸收-再散射過(guò)程，根據(jù)Miller、Anglister 和Steinberg 的RLS 理論，體系增強(qiáng)的散射光譜可以認(rèn)為是共振光散射。

圖2 為適體-AuNPs-腺苷體系在pH 4.6 BR 緩沖液中的RLS 圖譜。

由圖2 可知，在pH 4.6 BR 緩沖液中，單獨(dú)的AuNPs 的RLS 強(qiáng)度很弱(圖2a)，加入NaCl 溶液之后，AuNPs 在高鹽溶液中發(fā)生聚集，體系的RLS 強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(圖2b)。在AuNPs 溶液中加入腺苷適體，再加入NaCl 后，AuNPs 被腺苷適體保護(hù)，體系的RLS 強(qiáng)度減弱(圖2c)。在適體-AuNPs 復(fù)合物中加入腺苷，腺苷與腺苷適體特異性結(jié)合，金納米不被腺苷適體保護(hù)而在高鹽濃度下聚集，體系的RLS 強(qiáng)度增強(qiáng)(圖2d)，且隨著腺苷濃度增加，體系的RLS 依次增強(qiáng)，在λmax=540 nm 處，腺苷濃度與ΔI 在一定范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

圖2 適體-AuNPs-腺苷體系的RLS 光譜Fig.2 RLS spectra of aptamer-AuNPs-adenosine system

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.2.1 體系酸度及用量的影響 選用PBS、MES 和BR 3 種緩沖溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，在BR 緩沖液中，體系的RLS 強(qiáng)度的變化值最大。在BR 緩沖液中，隨著pH 增加，ΔI 值也不斷的上升，在pH 4.4～4.8 范圍內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，且在pH 4.6 時(shí)，ΔI 值最大，故本實(shí)驗(yàn)選擇pH 4.6 的BR 緩沖溶液35 μL 控制體系的酸度。

2.2.2 AuNPs 用量的影響 實(shí)驗(yàn)了AuNPs 用量對(duì)體系ΔI 值的影響。結(jié)果表明，當(dāng)AuNPs 用量在25～40 μL 時(shí)，體系的ΔI 值逐漸增大;繼續(xù)增加AuNPs 用量，體系的ΔI 值降低。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇AuNPs 的用量為40 μL。

2.2.3 NaCl 用量的影響 固定已優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件，探討了0.5 mol/L NaCl 溶液的用量對(duì)反應(yīng)體系的影響。結(jié)果表明，隨著NaCl 溶液用量增加，體系ΔI 值不斷變大，NaCl 溶液用量為50 μL 時(shí)，ΔI 達(dá)到最大值。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇適體用量為50 μL。

2.2.4 反應(yīng)時(shí)間的影響 研究了反應(yīng)時(shí)間在5 ～60 min 范圍內(nèi)體系的RLS 強(qiáng)度的變化。實(shí)驗(yàn)表明，反應(yīng)25 min 時(shí)，體系的ΔI 達(dá)到最大值，隨著時(shí)間繼續(xù)增加，體系的ΔI 值恒定不變，體系的穩(wěn)定性良好。故本實(shí)驗(yàn)選擇反應(yīng)時(shí)間為25 min。

2.3 干擾實(shí)驗(yàn)

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，腺苷濃度為1.5×10－11mol/L，實(shí)驗(yàn)了可能共存的多種離子或物質(zhì)對(duì)體系的影響。結(jié)果表明，當(dāng)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤5%時(shí)，1 000 倍的葡萄糖;260 倍的尿素;223 倍的;200 倍的Na+、K+、Ag+、Cl－、NO3－;100 倍的Pb2+、Hg2+、Al3+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、、F－、Br－、;82 倍的草酸;67 倍的EDTA 二鈉、Zn2+、Fe3+、Ba2+、尿苷、胸苷;47 倍的鳥苷;45 倍的I－、Cu2+;9 倍的胞苷等對(duì)測(cè)定沒有影響，可見該法有較好的選擇性。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及精密度

按照實(shí)驗(yàn)方法，加入不同體積腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，腺苷的濃度在1.9 ×10－12～2.0×10－11mol/L 范圍內(nèi)，與體系ΔI 有良好的線性關(guān)系，其回歸方程為ΔI =71.3 +17.0c(×10－12mol/L)，相關(guān)系數(shù)r=0.994 8。根據(jù)11 次空白樣品的平行測(cè)定，按公式LOD=3Sb/k(Sb和k 分別為空白管的標(biāo)準(zhǔn)差和直線回歸方程的斜率)計(jì)算，可得本方法的檢出限為5.7 ×10－13mol/L。平行配制11 管濃度分別為1.0 ×10－12，1.5 ×10－11，2.0 ×10－11mol/L的腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)。結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.48%，3.70%和2.52%。

2.5 樣品分析

采集南華大學(xué)學(xué)生尿樣1 和南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院糖尿病病人尿樣2 和腦梗阻病人尿樣3 各1 mL，以3 500 r/min 的 速 度 離 心10 min，用0.22 μm 針頭式過(guò)濾器過(guò)濾，取上清液，按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作，測(cè)定樣品中的腺苷含量和加標(biāo)回收率，結(jié)果見表1。

表1 樣品中腺苷檢測(cè)結(jié)果(n=6)Table 1 Determination results of adenosine in the samples(n=6)

3 結(jié)論

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，腺苷與腺苷適體特異性結(jié)合，AuNPs 失去適體的保護(hù)而聚集，導(dǎo)致體系的RLS 強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，且在一定的濃度范圍內(nèi)，體系的ΔI 與腺苷的濃度有良好的線性關(guān)系，據(jù)此建立了尿樣中痕量腺苷的檢測(cè)新方法。本方法應(yīng)用于實(shí)際尿樣中腺苷的檢測(cè)，簡(jiǎn)單、快速、選擇性好、檢出限低。

［1］ Zhang J Q，Wang Y S，Xue J H，et al. A gold nanoparticles-modified aptamer beacon for urinary adenosine detection based on structure-switching/fluorescence-“turning on”mechanism［J］. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2012，70:362-368.

［2］ Hsu W Y，Chen C J，Huang Y C，et al. Urinary nucleosides as biomarkers of breast，colon，lung，and gastric cancer in taiwanese ［J］. PLoS One，2013，8(12):e81701.

［3］ Contreras-Sanz A，Scott-Ward T S，Gill H S，et al.Simultaneous quantification of 12 different nucleotides and nucleosides released from renal epithelium and in human urine samples using ion-pair reversed-phase HPLC［J］.Purinergic Signal，2012，8(4):741-751.

［4］ Chen M L，Wei S S，Yuan B F，et al.Preparation of methacrylate-based monolith for capillary hydrophilic interaction chromatography and its application in determination of nucleosides in urine［J］.Journal of Chromatography A，2012，1228:183-192.

［5］ Hsu W Y，Chen W T，Lin W D，et al.Analysis of urinary nucleosides as potential tumor markers in human colorectal cancer by high performance liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry［J］.Clin Chim Acta，2009，402(1):31-37.

［6］ Zhang J Q，Wang Y S，He Y，et al.Determination of urinary adenosine using resonance light scattering of gold nanoparticles modified structure-switching aptamer［J］. Analytical Biochemistry，2010，397(2):212-217.

［7］ Lin J H，Tseng W L.A method for fluorescence sensing of adenosine and alkaline phosphatase based on the inhibition of S-adenosylhomocysteine hydrolase activity［J］.Biosensors and Bioelectronics，2013，41:379-385.

［8］ Qian Q M，Wang Y S，Yang H X，et al. Colorimetric detection of metallothioneins using a thymine-rich oligonucleotide-Hg complex and gold nanoparticles［J］.Anal Biochem，2013，436(1):45-52.