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        非標記適體-金納米檢測尿中痕量腺苷

        2014-12-23 01:03:58趙慧王愛芝王永生
        應(yīng)用化工 2014年3期
        關(guān)鍵詞:尿樣腺苷分光

        趙慧,王愛芝,王永生

        (南華大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院,湖南 衡陽 421001)

        研究表明,腫瘤細胞的快速增殖可導(dǎo)致腺嘌呤核苷酸降解,使腺苷的產(chǎn)生和排出增多,尿中腺苷可以作為潛在的腫瘤標志物[1-2]。因此,檢測尿液中腺苷含量對惡性腫瘤早期診斷、預(yù)后監(jiān)測等方面具有重要意義。

        目前測定尿中痕量腺苷的方法有高效液相色譜法[3]、毛細管電泳法[4]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5]、共振光散射法[6]、熒光分光光度法[7]等,這些方法雖然各有優(yōu)點,但都存在或多或少的不足。

        本文基于腺苷與未標記的腺苷適體特異性結(jié)合,金納米不被腺苷適體保護而在高鹽濃度下聚集,導(dǎo)致共振光散射增強的原理,建立RLS 測定腺苷的新方法,已用于尿樣中腺苷的測定。

        1 實驗部分

        1.1 試劑與儀器

        腺苷、氯金酸、檸檬酸三鈉、氯化鈉等均為分析純;腺苷適體為色譜純(序列號為5'-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3',臨用前需95 ℃5 min處理后,緩慢冷卻至室溫);實驗用水為滅菌雙蒸水;金納米,按參考文獻[8]制備。

        F-4500 熒光分光光度計;UV-2550 紫外-可見分光光度計;AB204-S 電子分析天平;PB-21 型精密酸度計。

        1.2 實驗方法

        于2 mL EP 管中依次加入pH 4.6 BR 緩沖溶液35 μL,1.0 μmol/L 腺苷適體20 μL 和不同體積的1.0 ×10-10mol/L 腺苷溶液,漩渦混勻,于37 ℃恒溫水浴箱中孵育30 min。加入金納米粒子40 μL,加入適量滅菌雙蒸水,混勻,室溫孵育25 min。加入0.5 mol/L NaCl 溶液50 μL,混勻后立即在熒光分光光度計上以λex=λem進行同步掃描,獲取RLS 光譜,記錄λmax=540 nm 處溶液RLS 強度(I)和試劑空白RLS 強度(I0),計算ΔI=I-I0。激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為5.0,10.0 nm,光電倍增管電壓為400 V。同時在紫外-可見分光光度計上掃描吸收光譜。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 光譜特征

        圖1 為適體-AuNPs-腺苷體系的吸收光譜圖和RLS 圖譜。

        圖1 適體-AuNPs-腺苷體系的吸收光譜(1)和RLS 光譜(2)Fig.1 Absorption and RLS spectra of aptamer-AuNPs-adenosine system

        由圖1 可知,適體-AuNPs-腺苷體系的最大RLS峰位于540 nm,處于體系的最大吸收峰附近。由于RLS 作用包括散射-吸收-再散射過程,根據(jù)Miller、Anglister 和Steinberg 的RLS 理論,體系增強的散射光譜可以認為是共振光散射。

        圖2 為適體-AuNPs-腺苷體系在pH 4.6 BR 緩沖液中的RLS 圖譜。

        由圖2 可知,在pH 4.6 BR 緩沖液中,單獨的AuNPs 的RLS 強度很弱(圖2a),加入NaCl 溶液之后,AuNPs 在高鹽溶液中發(fā)生聚集,體系的RLS 強度顯著增強(圖2b)。在AuNPs 溶液中加入腺苷適體,再加入NaCl 后,AuNPs 被腺苷適體保護,體系的RLS 強度減弱(圖2c)。在適體-AuNPs 復(fù)合物中加入腺苷,腺苷與腺苷適體特異性結(jié)合,金納米不被腺苷適體保護而在高鹽濃度下聚集,體系的RLS 強度增強(圖2d),且隨著腺苷濃度增加,體系的RLS 依次增強,在λmax=540 nm 處,腺苷濃度與ΔI 在一定范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

        圖2 適體-AuNPs-腺苷體系的RLS 光譜Fig.2 RLS spectra of aptamer-AuNPs-adenosine system

        2.2 實驗條件的優(yōu)化

        2.2.1 體系酸度及用量的影響 選用PBS、MES 和BR 3 種緩沖溶液進行實驗,結(jié)果表明,在BR 緩沖液中,體系的RLS 強度的變化值最大。在BR 緩沖液中,隨著pH 增加,ΔI 值也不斷的上升,在pH 4.4~4.8 范圍內(nèi)相對穩(wěn)定,且在pH 4.6 時,ΔI 值最大,故本實驗選擇pH 4.6 的BR 緩沖溶液35 μL 控制體系的酸度。

        2.2.2 AuNPs 用量的影響 實驗了AuNPs 用量對體系ΔI 值的影響。結(jié)果表明,當AuNPs 用量在25~40 μL 時,體系的ΔI 值逐漸增大;繼續(xù)增加AuNPs 用量,體系的ΔI 值降低。因此,本實驗選擇AuNPs 的用量為40 μL。

        2.2.3 NaCl 用量的影響 固定已優(yōu)化的實驗條件,探討了0.5 mol/L NaCl 溶液的用量對反應(yīng)體系的影響。結(jié)果表明,隨著NaCl 溶液用量增加,體系ΔI 值不斷變大,NaCl 溶液用量為50 μL 時,ΔI 達到最大值。因此,本實驗選擇適體用量為50 μL。

        2.2.4 反應(yīng)時間的影響 研究了反應(yīng)時間在5 ~60 min 范圍內(nèi)體系的RLS 強度的變化。實驗表明,反應(yīng)25 min 時,體系的ΔI 達到最大值,隨著時間繼續(xù)增加,體系的ΔI 值恒定不變,體系的穩(wěn)定性良好。故本實驗選擇反應(yīng)時間為25 min。

        2.3 干擾實驗

        在最佳實驗條件下,腺苷濃度為1.5×10-11mol/L,實驗了可能共存的多種離子或物質(zhì)對體系的影響。結(jié)果表明,當相對標準偏差≤5%時,1 000 倍的葡萄糖;260 倍的尿素;223 倍的;200 倍的Na+、K+、Ag+、Cl-、NO3-;100 倍的Pb2+、Hg2+、Al3+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、、F-、Br-、;82 倍的草酸;67 倍的EDTA 二鈉、Zn2+、Fe3+、Ba2+、尿苷、胸苷;47 倍的鳥苷;45 倍的I-、Cu2+;9 倍的胞苷等對測定沒有影響,可見該法有較好的選擇性。

        2.4 標準曲線、檢出限及精密度

        按照實驗方法,加入不同體積腺苷標準溶液,繪制標準曲線。結(jié)果表明,腺苷的濃度在1.9 ×10-12~2.0×10-11mol/L 范圍內(nèi),與體系ΔI 有良好的線性關(guān)系,其回歸方程為ΔI =71.3 +17.0c(×10-12mol/L),相關(guān)系數(shù)r=0.994 8。根據(jù)11 次空白樣品的平行測定,按公式LOD=3Sb/k(Sb和k 分別為空白管的標準差和直線回歸方程的斜率)計算,可得本方法的檢出限為5.7 ×10-13mol/L。平行配制11 管濃度分別為1.0 ×10-12,1.5 ×10-11,2.0 ×10-11mol/L的腺苷標準溶液進行精密度實驗。結(jié)果相對標準偏差(RSD)分別為1.48%,3.70%和2.52%。

        2.5 樣品分析

        采集南華大學(xué)學(xué)生尿樣1 和南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院糖尿病病人尿樣2 和腦梗阻病人尿樣3 各1 mL,以3 500 r/min 的 速 度 離 心10 min,用0.22 μm 針頭式過濾器過濾,取上清液,按實驗方法進行操作,測定樣品中的腺苷含量和加標回收率,結(jié)果見表1。

        表1 樣品中腺苷檢測結(jié)果(n=6)Table 1 Determination results of adenosine in the samples(n=6)

        3 結(jié)論

        在優(yōu)化的實驗條件下,腺苷與腺苷適體特異性結(jié)合,AuNPs 失去適體的保護而聚集,導(dǎo)致體系的RLS 強度顯著增強,且在一定的濃度范圍內(nèi),體系的ΔI 與腺苷的濃度有良好的線性關(guān)系,據(jù)此建立了尿樣中痕量腺苷的檢測新方法。本方法應(yīng)用于實際尿樣中腺苷的檢測,簡單、快速、選擇性好、檢出限低。

        [1] Zhang J Q,Wang Y S,Xue J H,et al. A gold nanoparticles-modified aptamer beacon for urinary adenosine detection based on structure-switching/fluorescence-“turning on”mechanism[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2012,70:362-368.

        [2] Hsu W Y,Chen C J,Huang Y C,et al. Urinary nucleosides as biomarkers of breast,colon,lung,and gastric cancer in taiwanese [J]. PLoS One,2013,8(12):e81701.

        [3] Contreras-Sanz A,Scott-Ward T S,Gill H S,et al.Simultaneous quantification of 12 different nucleotides and nucleosides released from renal epithelium and in human urine samples using ion-pair reversed-phase HPLC[J].Purinergic Signal,2012,8(4):741-751.

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        [8] Qian Q M,Wang Y S,Yang H X,et al. Colorimetric detection of metallothioneins using a thymine-rich oligonucleotide-Hg complex and gold nanoparticles[J].Anal Biochem,2013,436(1):45-52.

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