刁興利，喬紅梅，陳磊

(天津大學(xué) 藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072)

安立生坦(Ambrisentan)是一種口服選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑，化學(xué)名為(+)-(2S)-2-［(4，6-二甲基嘧啶-2-基)氧］-3-甲氧基-3，3-二苯基丙酸，是目前世界上用于治療肺動脈高壓癥的有效藥物［1-2］。安立生坦是一種手性藥物［3］，以S 活性構(gòu)型具有治療作用［4-5］，其合成工藝有多種，一種為二苯甲酮經(jīng)Darzens 反應(yīng)、醇解、親核取代和水解等反應(yīng)，得到安立生坦的消旋體，再經(jīng)過拆分得到光學(xué)活性的安立生坦，該方法成本較高［6-7］;一種為二苯甲酮經(jīng)Darzens 反應(yīng)，醇解、水解、(S)-對氯苯乙胺拆分、縮合，得到光學(xué)純度的安立生坦，此法所用拆分劑基因毒性大［8］。本實驗用L-脯氨酸甲酯代替第二種方法中所用拆分劑，拆分效果相似，不僅降低了可能存在的生物毒性，而且節(jié)約成本。產(chǎn)物進行質(zhì)量分析來監(jiān)控安立生坦原料藥的質(zhì)量情況，此時L-脯氨酸甲酯就作為相關(guān)雜質(zhì)應(yīng)被進行檢測，使其符合原料藥雜質(zhì)限度要求［9］。由于L-脯氨酸甲酯作為雜質(zhì)含量較少，且其結(jié)構(gòu)中只有一個發(fā)色團羰基，所以使用常規(guī)的紫外檢測器很難檢測到。

4-氯-7-硝基苯-2-噁-1，3-二唑(NBD-Cl)是一種活性鹵類熒光試劑，幾乎能跟所有伯胺和仲胺類化合物反應(yīng)，其衍生速率較快，副產(chǎn)物少，衍生條件溫和，衍生產(chǎn)物的最大激發(fā)波長為480 nm［10-11］。根據(jù)這個性質(zhì)，NBD-Cl 可與L-脯氨酸甲酯中的仲胺進行衍生反應(yīng)，其衍生產(chǎn)物帶有熒光，使用靈敏度較高的熒光檢測器進行檢測［12］，從而達到對安立生坦原料藥中的L-脯氨酸甲酯進行定量分析檢測的目的。但安立生坦無熒光，需借助紫外檢測器進行檢測。

本研究建立了柱前衍生-高效液相色譜法，由紫外檢測器串聯(lián)熒光檢測器檢測安立生坦原料藥中的手性拆分劑雜質(zhì)L-脯氨酸甲酯的方法，能快速、簡便有效地對雜質(zhì)進行分析檢測。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

安立生坦、L-脯氨酸甲酯，天津大學(xué)藥物化學(xué)實驗室提供，純度均大于99.5%;NBD-Cl、甲醇、硼酸、磷酸三乙胺、無水磷酸氫二鈉、氫氧化鈉均為分析純。

Agilent 1200 高效液相色譜系統(tǒng)，包括進樣器G1329A，四元泵G1311A，真空脫氣機G1322A，柱溫箱G1316A，紫外檢測器G1314B;RF-535 熒光檢測器;Baseline C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);SENCO W201 恒溫水浴鍋;AS3120 超聲儀;Milli-Q水凈化系統(tǒng)。

1.2 色譜條件

Baseline C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流速1 mL/min，柱溫40 ℃，紫外檢測器波長為254 nm，熒光檢測激發(fā)波長473 nm，發(fā)射波長534 nm，進樣量20 μL。流動相A:甲醇，流動相B:磷酸氫二鈉緩沖液(pH =6.5)，按照表1 進行梯度洗脫。

表1 流動相梯度洗脫溶劑程序Table 1 Gradient elution program of mobile phase

1.3 溶液配制

1.3.1 L-脯氨酸甲酯溶液的配制 取L-脯氨酸甲酯適量，加入甲醇溶解，定容成0.25 mg/mL 的儲備液。再精密移取1 mL 儲備液置于100 mL 容量瓶，稀釋至刻度，得到2. 5 μg/mL 的L-脯氨酸甲酯溶液。

1.3.2 安立生坦溶液的配制 取安立生坦適量加入甲醇溶解，定容成2.5 mg/mL 溶液。

1.3.3 衍生試劑溶液的配制 取NBD-Cl 適量，加入甲醇溶解，定容成3.0 mg/mL 溶液。

1.3.4 流動相緩沖溶液的配制 取1.42 g 無水磷酸氫二鈉溶于500 mL 純水中，超聲溶解，加入50 μL三乙胺，再用磷酸調(diào)節(jié)pH 至6.5，制成20 mmol/L的磷酸氫二鈉流動相緩沖液。

1.3.5 衍生反應(yīng)緩沖溶液的配制 取1.86 g 硼酸溶于100 mL 水中，用1 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH=9，制成0.3 mol/L 的硼酸緩沖液作為衍生反應(yīng)緩沖液。

1.4 柱前衍生化反應(yīng)

取100 μL 2.5 μg/mL 的L-脯氨酸甲酯溶液、100 μL 3 mg/mL 的NBD-Cl 溶液、200 μL 衍生反應(yīng)緩沖液(pH=9)置于棕色進樣瓶中，補充600 μL 甲醇至1 mL 體系，用聚四氟乙烯帶密封，超聲3 min，置于60 ℃水浴中加熱。60 min 后取出，置于冰水浴中冷卻，停止反應(yīng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生化條件的影響

2.1. 1 衍生反應(yīng)溫度的影響 分別在室溫(23 ℃)、40，50，60，70，80 ℃下進行衍生反應(yīng)(此時固定反應(yīng)時間為30 min，衍生試劑加入量為100 μL 1 mg/mL 的NBD-Cl 溶液，緩沖溶液pH 為8)，記錄熒光譜圖中衍生產(chǎn)物的峰面積，結(jié)果見圖1。

圖1 衍生反應(yīng)溫度對衍生反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of derivatization temperature on derivatization reaction

由圖1 可知，衍生產(chǎn)物的檢測峰面積隨溫度的升高而逐漸增大，溫度升至60 ℃時，峰面積有較明顯增加，隨后增加趨勢減緩;而且本實驗反應(yīng)體系大部分為甲醇，甲醇的沸點為64 ℃，高于此溫度時不利于體系穩(wěn)定。所以，選定衍生反應(yīng)溫度為60 ℃。

2.1.2 衍生反應(yīng)時間的影響 在反應(yīng)溫度60 ℃下，考察了反應(yīng)時間120 min 內(nèi)反應(yīng)后進樣分析，記錄熒光譜圖中衍生產(chǎn)物的峰面積，結(jié)果見圖2。

圖2 衍生反應(yīng)時間對衍生反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of derivatization time on derivatization reaction

由圖2 可知，衍生產(chǎn)物峰面積隨反應(yīng)時間的延長而逐漸增大，但60 min 后增加趨勢逐漸緩慢。在保證檢測靈敏度的基礎(chǔ)上，應(yīng)使反應(yīng)更加方便快捷地完成，確定衍生反應(yīng)時間為60 min。

2.1.3 衍生試劑加入量的影響 衍生試劑的加入量對于L-脯氨酸甲酯的反應(yīng)完全程度有重要影響［13］，進而會影響其定量的準(zhǔn)確性。保持衍生試劑濃度為1 mg/mL 時，分別加入0，10，50，100，300，600 μL 衍生試劑NBD-Cl 溶液，進行衍生反應(yīng)(反應(yīng)時間為60 min，反應(yīng)溫度60 ℃，衍生反應(yīng)緩沖溶液pH 為8)，記錄熒光譜圖中衍生產(chǎn)物的峰面積，結(jié)果見圖3。

圖3A 表示熒光譜圖中衍生產(chǎn)物的峰面積隨衍生試劑加入量的變化情況，圖3B 表示紫外譜圖中衍生反應(yīng)后剩余NBD-Cl 的峰面積，二者隨衍生試劑加入量都呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢。為確保衍生產(chǎn)物檢測的靈敏度，同時考慮反應(yīng)試劑的充分利用，確定在反應(yīng)體系中加入0.3 mg/mL 衍生試劑。

圖3 衍生試劑加入量對熒光譜圖中衍生產(chǎn)物(A)和紫外譜圖中反應(yīng)中剩余的NBD-Cl(B)的檢測靈敏度的影響Fig.3 Effect of amounts of derivatization reagent on detection sensitivity of derivatization product in fluorescence detector and residual NBD-Cl in ultraviolet detector

2.1.4 衍生反應(yīng)緩沖液pH 的影響 在pH 5.0 ～10.0 的范圍內(nèi)，考察衍生反應(yīng)緩沖液對衍生反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4 可知，在pH 5.0 ～9.0 之間，隨著pH 的升高，衍生試劑NBD-Cl 的反應(yīng)活性增加，衍生產(chǎn)物峰面積逐漸升高;當(dāng)pH 由9.0 升至10.0 時，產(chǎn)物峰面積明顯下降，這是因為隨著堿性增強，衍生試劑發(fā)生水解，反應(yīng)活性減弱。綜合上述結(jié)果，確定衍生反應(yīng)緩沖溶液pH=9.0。

圖4 衍生反應(yīng)緩沖液pH 值對衍生反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of pH of derivatization buffersolution on derivatization reaction

2.2 方法學(xué)驗證

2.2.1 專屬性 分別將L-脯氨酸甲酯樣品及未加入樣品的空白對照進行柱前衍生化實驗，色譜分析結(jié)果見圖5。

圖5 專屬性對比譜圖Fig.5 Chromatograms of the method specificity test

由圖5 可知，在L-脯氨酸甲酯衍生產(chǎn)物出峰處，沒有其他雜質(zhì)干擾，峰形較好，專屬性較高。

2.2.2 檢測限和定量限 將L-脯氨酸甲酯樣品溶液逐級稀釋，分別以信噪比的3 倍和10 倍，確定L-脯氨酸甲酯的檢測限和定量限。最后將檢測限定為2.5 ×10－3μg/mL，定量限為7.5 ×10－3μg/mL。2.2. 3 線性與范圍 將L-脯氨酸甲酯溶液(2.5 μg/mL)逐 級 稀 釋 為 安 立 生 坦 濃 度(2.5 mg/mL)的0. 3%，0. 2%，0. 15%，0. 10%，0.05%，0.025%，分別進行衍生反應(yīng)后，記錄色譜分析衍生產(chǎn)物熒光峰面積，進行線性回歸，得線性方程為y=1E +06x +271.78(R2=0.999 4)，線性范圍為0.625 ～7.5 μg/mL。

2.2.4 重復(fù)性實驗 平行測定6 個L-脯氨酸甲酯衍生反應(yīng)樣品，記錄衍生產(chǎn)物色譜峰面積，計算RSD 值為0.33%，表明此方法重現(xiàn)性良好。

2.2. 5 加樣回收率 移取安立生坦溶液(2.5 mg/mL)各100 μL 置于9 個棕色瓶中，分別加入3 個濃度水平的L-脯氨酸甲酯，制得L-脯氨酸甲酯濃度為安立生坦的0.05%，0.10%，0.15%的溶液各3 個。分別進行衍生反應(yīng)后，記錄色譜分析衍生產(chǎn)物熒光峰面積，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算每個濃度下的回收率、平均回收率及精密度RSD，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率、平均回收率及精密度RSD Table 2 Recoveries，average recoveries and RSD

2.2.6 方法耐用性 在色譜條件(流速、柱溫、流動相緩沖液pH、流動相初始比例)稍作改動的情況下，測定衍生反應(yīng)后的產(chǎn)物生成量，考察衍生產(chǎn)物出峰的保留時間、理論塔板數(shù)、拖尾因子及分離度的變化情況，結(jié)果見表3。

由表3 可知，這些微小變化對各評價參數(shù)影響不大，說明該方法具有很好的耐用性。

表3 耐用性考察數(shù)據(jù)Table 3 Data of ruggedness tests

續(xù)表3

2.2.7 L-脯氨酸甲酯溶液的穩(wěn)定性 配制L-脯氨酸甲酯溶液(2.5 μg/mL)溶液，室溫放置，在48 h內(nèi)取樣進行衍生反應(yīng)［14］，進行色譜分析，計算衍生產(chǎn)物峰面積的RSD。三次進樣峰面積RSD 為1.1%，說明樣品在48 h 內(nèi)可以穩(wěn)定存在。

2.2.8 衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性 加入100%甲酯進行衍生反應(yīng)后，將同一衍生反應(yīng)在9 h 內(nèi)進樣分析，觀察峰面積的變化，結(jié)果見表4。

表4 衍生產(chǎn)物峰面積變化率Table 4 Change rate of peak area of derivatization product

由表4 可知，隨著放置時間的增加，衍生反應(yīng)峰面積略有增加。原因可能為由于體系進樣后不再處于密封狀態(tài)，反應(yīng)體系中的甲醇不可避免會有揮發(fā)而導(dǎo)致液體體積減小，衍生產(chǎn)物濃度增大，再次進樣相同體積，得到的峰面積會稍有變化，但變化程度很小，不影響對L-脯氨酸甲酯的定量分析。結(jié)果說明衍生產(chǎn)物在反應(yīng)后9 h 內(nèi)較為穩(wěn)定，所以進行液相分析應(yīng)盡量在衍生反應(yīng)后9 h 內(nèi)。

3 結(jié)論

通過對衍生化條件和色譜條件進行優(yōu)化，首次建立了以NBD-Cl 作為衍生試劑的柱前衍生化-反相高效液相色譜測定法，用于檢測安立生坦原料藥中殘余的手性拆分劑L-脯氨酸甲酯，該方法簡單易行，重復(fù)性好，靈敏度高，適用于安立生坦雜質(zhì)限量的檢測。

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