陳程
(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,陜西 西安 710021)
黃連為毛莨科植物黃連的干燥根莖[1]。鹽酸小檗堿為黃連中含量最高的原小檗堿型生物堿,也是最重要的活性成分之一,具有抗炎、抗菌、抗癌,治療糖尿病和心血管疾病,及抑制脂肪分化等多方面藥理作用[2-3]。鹽酸小檗堿是一種季銨生物堿,其鹽類在水中溶解度低,水提不能達(dá)到很好的提取效果[4]。故本研究選用乙醇回流提取。
以鹽酸小檗堿含量和干膏得率作為評價(jià)指標(biāo),采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選最佳醇提工藝。
黃連飲片,經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院生藥教研室鑒定為毛茛科植物黃連的干燥根莖;鹽酸小檗堿(批號110733-200806);乙腈、甲醇均為色譜純;水為雙蒸餾水;乙醇、鹽酸均為分析純。
Waters 2695 高效液相色譜儀,Waters 2695 泵,Waters 2996 二極管陣列檢測器,Empower2 色譜工作站;Fw-200 高速萬能粉碎機(jī);RE-52-05 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;梅特勒GB204 電子天平(萬分之一)。
稱取黃連藥材9 份,每份10 g,分別按L9(34)正交表安排的方案進(jìn)行提取,提取液備用。測定并計(jì)算鹽酸小檗堿含量和干膏得率。正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。
表1 因素水平Table 1 Factors and levels
1.3.1 色譜條件 色譜柱為Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀 溶 液(50 ∶50,pH 調(diào) 為4. 0),檢 測 波 長345 nm,流速1.0 mL/min,柱溫25 ℃。
1.3.2 對照品溶液制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量,加甲醇制成每1 mL 含10 μg 的溶液。
1.3.3 供試品溶液制備 分別精密移取0.1 mL 提取液,置于蒸發(fā)皿中,水浴蒸干。用甲醇溶解至10 mL容量瓶中,用甲醇定容,過濾,取續(xù)濾液,即得。
1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取對照品溶液2,5,10,15,20 μL 進(jìn)樣,測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)作圖,線性回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,y=156 548x+27 954,R2=0.999 6。表明鹽酸小檗堿在進(jìn)樣量0.02 ~0.2 μg 內(nèi),線性關(guān)系良好。
1.3.5 樣品含量測定 分別注入對照品溶液和供試品溶液各10 μL 于液相色譜儀中,計(jì)算鹽酸小檗堿含量。
精密量取提取液5 mL,置蒸發(fā)皿中水浴蒸干,減壓干燥,精密稱定質(zhì)量,計(jì)算干膏得率。
正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2,方差分析見表3。
表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test
由表2 可知,各因素的影響次序依次為C >D >B >A,即溶劑用量>提取次數(shù)>提取時(shí)間>乙醇濃度。方差分析結(jié)果表明,C(溶劑用量)因素有顯著性影響(P <0.05)。從實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)考慮,選定最佳工藝條件為A1B1C3D3,即50%乙醇提取3 次,每次提取時(shí)間1.5 h,3 次加醇量分別為8,6,6 倍。
表3 方差分析Table 3 Analysis of variance
按照正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出的最佳工藝條件重復(fù)3次,以驗(yàn)證該提取工藝條件是否具有重現(xiàn)性,結(jié)果見表4。結(jié)果表明該提取工藝穩(wěn)定、可行。
表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 4 Verification experiment results(n=3)
2.3.1 精密度 精密吸取對照品溶液10 μL 進(jìn)樣,重復(fù)進(jìn)樣5 次,測定鹽酸小檗堿峰面積積分值。結(jié)果RSD 值為1.01%。
2.3.2 穩(wěn)定性 精密吸取供試品溶液,于12 h 內(nèi)測定,結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積RSD 值為0.55%,供試品溶液在0 ~12 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。
2.3.3 重復(fù)性 取同一批的黃連藥材5 份,制備5份供試品溶液,測定并計(jì)算鹽酸小檗堿峰面積的RSD 值為1.37%,重復(fù)性良好。
2.3.4 加樣回收率 精密移取6 份已知含量的樣品0. 05 mL,置蒸發(fā)皿中,分別精密加入相當(dāng)0.05 mL 樣品溶液80%,100%,120%的鹽酸小檗堿對照品溶液,按照供試品溶液制備方法和色譜條件測定,測得平均回收率為99.73%,RSD 為1.01%。結(jié)果表明,本方法回收率良好。
(1)黃連中鹽酸小檗堿的醇提最佳工藝條件為:50%乙醇提取3 次,每次提取時(shí)間1.5 h,3 次加醇量分別8,6,6 倍。該醇提工藝重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好。
(2)用HPLC 法測定黃連中鹽酸小檗堿含量,該方法分離較好,穩(wěn)定可行。
[1] 鄭漢臣.藥用植物與生藥學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2006.
[2] 崔學(xué)軍.小檗堿的藥理學(xué)研究進(jìn)展及臨床新用途[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2006,17(7):1311-1312.
[3] Niu Lingying,Qiao Wei,Hu Zhendong,et al.Berberine attenuates lipopolysaccharide induced impairments of intestinal glutamine transport and glutaminase activity in rat[J].Fitoterapia,2011,82(3):323-330.
[4] 徐媛.正交試驗(yàn)法優(yōu)選黃連中小檗堿提取工藝[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2011,18(5):60-61.