徐慧敏 ,閆 海 ?,馬 松 ,王華生 ,2,尹春華 ,劉曉璐 (.北京科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院,北京00083；2.江西理工大學(xué)建筑與測(cè)繪工程學(xué)院,江西 贛州 34000)

鞘氨醇單胞菌USTB-05對(duì)微囊藻毒素的生物降解

徐慧敏1,閆 海1?,馬 松1,王華生1,2,尹春華1,劉曉璐1(1.北京科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院,北京100083；2.江西理工大學(xué)建筑與測(cè)繪工程學(xué)院,江西 贛州 341000)

研究了云南滇池水華藍(lán)藻細(xì)胞中微囊藻毒素(MCs)的分析和鞘氨醇單胞菌USTB-05在細(xì)胞水平和酶水平下對(duì)MC-YR、RR和LR的生物降解.結(jié)果表明,云南滇池水華藍(lán)藻細(xì)胞中 MC-YR、RR和 LR的含量分別為 0.16, 0.96, 0.47mg/g.在初始濃度分別為 19.5mg/L MC-YR、79.5mg/L MC-RR和43.6mg/L MC-LR下,鞘氨醇單胞菌USTB-05在2d內(nèi)可將上述3種MCs全部降解,鞘氨醇單胞菌USTB-05粗酶液可以以更快的速率對(duì) MC-YR、MC-RR和 MC-LR進(jìn)行高效酶催化降解,在 10h內(nèi)可以將初始濃度分別為 14.8mg/L MC-YR、28.4mg/L MC-RR和19.5mg/L MC-LR全部降解.同時(shí)發(fā)現(xiàn)了MC-YR降解過(guò)程中的2個(gè)中間和1個(gè)最終代謝產(chǎn)物.

微囊藻毒素；鞘氨醇單胞菌USTB-05；酶；生物降解

在淡水藍(lán)藻水華產(chǎn)生的不同藻毒素中,微囊藻毒素(MCs)是出現(xiàn)頻率最高、產(chǎn)生量最大和造成危害最嚴(yán)重的藻毒素種類(lèi),肝臟是其作用的主要靶器官[1-3].MCs是一類(lèi)化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定的化合物,在300℃高溫下還能維持長(zhǎng)時(shí)間不分解[4].目前,國(guó)內(nèi)外雖然發(fā)現(xiàn)有80多種不同類(lèi)型的MCs,但在我國(guó)主要以MC-RR和MC-LR為主[5-6].

生物降解是目前發(fā)現(xiàn)最有效去除MCs的方法,Jones等[7]從天然水體中首次分離出了對(duì)MC-LR有降解能力的鞘氨醇單胞菌ACM-3962,隨后 Bourne等[8-9]研究了鞘氨醇單胞菌 MJ-PV酶催化降解 MC-LR的途徑與分子機(jī)理,發(fā)現(xiàn)至少有4種酶參與了MC-LR的代謝過(guò)程.本課題組從云南滇池底泥中成功篩選出了能夠高效降解 MCs的菌株鞘氨醇單胞菌 USTB-05[10],并系統(tǒng)地研究了其降解MCs的動(dòng)力學(xué)過(guò)程與優(yōu)化控制條件[11-13].目前關(guān)于MCs生物降解的研究已進(jìn)入分子水平,降解基因已經(jīng)成功克隆和表達(dá)[14-15],生物降解MC-RR和MC-LR的途徑與分子機(jī)理已經(jīng)基本搞清楚[8,16].關(guān)于 MC-YR的研究報(bào)道,有優(yōu)化 MC-YR的高效液相色譜檢測(cè)法并對(duì)某水庫(kù) MC-YR的污染水平及環(huán)境因子進(jìn)行春、夏、秋、冬 4個(gè)季節(jié)的監(jiān)測(cè),分析了水體中微囊藻毒素(MC-YR)質(zhì)量濃度的季節(jié)變化特征及其與水體中總氮、總磷、CODMn和浮游藻類(lèi)等富營(yíng)養(yǎng)化指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系[17-19].也有報(bào)道利用二氧化氯氧化方法和紫外-微臭氧工藝去除水體中MC-YR及其氧化機(jī)理研究[20-21].但利用生物法高效降解 MC-YR及其降解途徑與分子機(jī)理研究方面報(bào)道相比較少.

本文在發(fā)現(xiàn)云南滇池藍(lán)藻細(xì)胞不僅產(chǎn)生常見(jiàn)的MC-RR和MC-LR,還發(fā)現(xiàn)具有2個(gè)苯環(huán)結(jié)構(gòu)更復(fù)雜的 MC-YR.大多數(shù)情況下,一種菌只能降解一種藻毒素,但本研究發(fā)現(xiàn)可降解多種藻毒素的菌種,USTB-05不僅能夠降解 MC-RR和MC-LR,而且對(duì)MC-YR也具有很強(qiáng)的降解能力.研究了在鞘氨醇單胞菌USTB-05細(xì)胞和酶水平生物降解上述3種MCs的動(dòng)力學(xué)過(guò)程,旨在為生物法降解MC-YR提供參考.

1 材料與方法

1.1 MCs

標(biāo)準(zhǔn)品 MC-YR(分子式:C52H72N10O13,分子量:1045.19)、MC-RR(分子式:C49H75N13O12,分子量:1038.2)和 MC-LR(分子式:C49H74N10O12,分子量:995.2)均購(gòu)自美國(guó) Sigma公司,純度＞95%.生物降解實(shí)驗(yàn)所用的 MC-YR、MC-RR和MC-LR采用文獻(xiàn)[22]方法從云南滇池水華藍(lán)藻細(xì)胞中提取獲得.

1.2 菌種、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

鞘氨醇單胞菌降解菌株(USTB-05)系本實(shí)驗(yàn)室篩選保存[10],采用文獻(xiàn)[23]的方法培養(yǎng).

1.3 USTB-05降解MCs的動(dòng)力學(xué)

分別吸取 0.1mL USTB-05菌液接種到含MC-YR、MC-RR和 MC-LR的培養(yǎng)基[24]中;用NaOH和HCl調(diào)節(jié)初始pH值[25]分別為5.0, 6.0,7.0, 8.0和9.0,研究USTB-05菌在不同pH值下對(duì) MCs的降解效應(yīng).實(shí)驗(yàn)在溫度 30℃,搖床轉(zhuǎn)速200r/min下進(jìn)行.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每12h 取樣,經(jīng)離心(12000r/min, 10min)后取上清液用 HPLC檢測(cè)MCs濃度變化[26].

1.4 酶催化降解MCs

離心(12000r/min,10min)收獲USTB-05細(xì)胞,采用文獻(xiàn)[27]方法制備粗酶液(CE).MCs的酶催化降解反應(yīng)在50mmol/L的磷酸鹽緩沖液體系中進(jìn)行,條件為溫度 30℃,搖床轉(zhuǎn)速 200r/min.樣品經(jīng)12000r/min、10min離心后取上清液在HPLC上測(cè)定[26].

2 結(jié)果與討論

2.1 MC-YR、MC-RR和MC-LR的提取

圖1 滇池藍(lán)藻細(xì)胞提取液中MC-YR、MC-RR和MC-LR的HPLC圖譜Fig.1 HPLC Spectrum of Extracted MC-YR, MC-RR and MC-LR from Dianchi cyanobacterial cells

標(biāo)準(zhǔn)品 MC-YR、MC-RR和 MC-LR在HPLC上出峰的保留時(shí)間分別為 13.21,6.98,15.89min,滇池藍(lán)藻細(xì)胞提取液同樣在保留時(shí)間13.21,6.98,15.89min左右(圖1)也有對(duì)應(yīng)出峰,其在 200～300nm 的紫外掃描圖譜分別與標(biāo)準(zhǔn)品MC-YR、MC-RR和MC-LR掃描圖譜一致,只是其濃度較低,均在 238nm 左右處有最大吸收峰.另外,通過(guò)改變流動(dòng)相后發(fā)現(xiàn)樣品中的 MCs與標(biāo)準(zhǔn)品中3種MCs的出峰時(shí)間、掃描吸收峰形和最大吸收峰的波長(zhǎng)范圍完全一致.研究結(jié)果表明,采集的滇池水華藍(lán)藻細(xì)胞中所含的化合物是MC-YR、MC-RR和MC-LR3種類(lèi)型的MCs,其中 MC-RR的含量遠(yuǎn)高于 MC-YR和MC-LR.根據(jù) MC-YR、MC-RR和 MC-LR的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出藍(lán)藻細(xì)胞干重中MC-YR、MC-RR和 MC-LR的含量分別為 0.16, 0.96,0.47mg/g,可作為降解底物進(jìn)行進(jìn)一步的降解活性研究.因國(guó)內(nèi)外至今尚未研究確定適合不同藻類(lèi)提取 MCs的最有效提取方法,所以很難確定藻細(xì)胞中 MCs的準(zhǔn)確含量.目前,我國(guó)和世界的各大湖泊水庫(kù)的藍(lán)藻水華樣品中,發(fā)現(xiàn)有MC-RR和 MC-LR的報(bào)道較多,而發(fā)現(xiàn)有MC-YR的報(bào)道相比較少.本研究成功從云南滇池水華藍(lán)藻細(xì)胞中提取出 MC-YR并定量,為MC-YR的生物降解理論和降解飲用水中MC-YR提供依據(jù).

2.2 USTB-05降解 MC-YR、MC-RR和MC-LR的動(dòng)力學(xué)

在MCs為唯一碳源和氮源條件下,USTB-05在 2d內(nèi)能夠?qū)⒊跏紳舛确謩e為 19.5,79.5,43.6mg/L的MC-YR、MC-RR和MC-LR全部降解(圖 2),日均降解能力分別為 9.8,39.8,21.8mg/L,說(shuō)明USTB-05對(duì)MCs具有很強(qiáng)的生物降解能力.USTB-05系本課題組篩選的3種菌株中生物降解MCs能力最強(qiáng)的菌株,其第1個(gè)降解基因已成功克隆和表達(dá),降解 MC-RR和MC-LR的途徑與分子機(jī)理已經(jīng)基本確定[15,28-29].本研究在對(duì)目前國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道較多的MC-RR和 MC-LR降解的同時(shí),尤其對(duì)研究報(bào)道還不廣泛的MC-YR進(jìn)行了高效的生物降解.

圖2 USTB-05降解MCs 的動(dòng)力學(xué)Fig.2 Kinetics of MCs biodegradation by USTB-05

2.3 初始pH值對(duì)USTB-05降解MCs的影響

圖3 pH值對(duì)USTB-05降解MCs的效應(yīng)Fig.3 Effects of pH on the biodegradation of MCs by USTB-05

大多數(shù)情況下,一種菌只能降解一種藻毒素,但本研究發(fā)現(xiàn)可降解多種藻毒素的菌種,USTB-05不僅能夠降解MC-RR和MC-LR,而且對(duì)MC-YR也具有很強(qiáng)的降解能力.溫度和pH值是影響USTB-05對(duì)MCs降解活性的重要因素,溫度約 30℃,pH值中性或弱堿性,具有高降解活性[30].圖3中,MC-YR、MC-RR和MC-LR的濃度在2d內(nèi)基本沒(méi)有變化,而當(dāng)初始pH值7.0和8.0時(shí), MC-YR、MC-RR和MC-LR濃度均明顯降低,2d內(nèi)可基本全部降解,特別是當(dāng)初始pH值7.0時(shí)降解速率更快.采用r檢驗(yàn)法來(lái)驗(yàn)證該結(jié)果是否具有顯著性.初始pH值對(duì)MC-YR降解效應(yīng),其檢驗(yàn)顯著水平值 r3,0.01=0.9912＜11.65;初始 pH值對(duì) MC-RR降解效應(yīng),其檢驗(yàn)顯著水平值r3,0.01= 0.9912＜6.08;初始pH值對(duì)MC-LR降解效應(yīng),其檢驗(yàn)顯著水平值 r3,0.01=0.9912＜12.73.所以認(rèn)為初始pH值對(duì)USTB-05降解3種MCs效應(yīng)都具有顯著性影響,且置信度為95%.

本研究結(jié)果說(shuō)明,該菌在降解MCs過(guò)程中對(duì)環(huán)境的酸堿度有一定要求,中偏堿性條件更適合MCs的生物降解,這和已報(bào)道的幾株MCs降解細(xì)菌相似.假單胞菌M-6的胞內(nèi)粗酶受pH值影響顯著,在pH6～8中性范圍內(nèi)降解MC-LR速率較快[31],此報(bào)道與本研究結(jié)果相似,說(shuō)明 USTB-05降解MCs對(duì)pH值變化比較敏感,在稍偏堿性條件下活性較高(圖3).藍(lán)藻水華發(fā)生的水體上層因藍(lán)藻的光合活性 pH值呈較強(qiáng)堿性[32-33],而在處理池中藻水混合物 pH值相對(duì)較低,一般在6.9～8.5,這與USTB-05對(duì)MCs高降解活性的pH值區(qū)間大致是相吻合的,因此藍(lán)藻死亡裂解后釋放的MCs可以被更快速降解.本研究結(jié)果也顯示在pH值較高(＞9)的水體暴發(fā)藍(lán)藻水華時(shí),其產(chǎn)生的MCs不易發(fā)生生物降解,這也是造成MCs積累引起危害的重要原因之一.

2.4 USTB-05酶促M(fèi)Cs降解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

圖4 USTB-05酶催化降解MCs的動(dòng)力學(xué)Fig.4 Biodegradation kinetics of MCs catalyzed by enzymes of USTB-05

利用USTB-05菌粗酶液對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品MC-YR、MC-RR和MC-LR進(jìn)行酶催化降解,發(fā)現(xiàn)在10h內(nèi)可將初始濃度分別為14.8,28.4,19.5mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品MC-YR、MC-RR和MC-LR全部降解(圖4),與USTB-05細(xì)胞水平 (圖2)相比具有更強(qiáng)的降解能力.酶催化降解是高效去除 MC-RR和MC-LR2種MCs的有效途徑之一[16,27],本研究發(fā)現(xiàn),USTB-05粗酶液同樣可以高效降解結(jié)構(gòu)更復(fù)雜帶有 2個(gè)苯環(huán)的 MC-YR.因此可直接采用微生物酶作為一種可生長(zhǎng)或不可生長(zhǎng)的生物催化劑,通過(guò)投加達(dá)到高效去除 MCs污染的目的,這可能是進(jìn)行原位生物修復(fù)高效去除飲用水源地中MCs的優(yōu)化控制方法.

2.5 USTB-05菌酶催化降解MC-YR

圖 5中,初始時(shí)只有在保留時(shí)間 12.4min的MC-YR出峰,反應(yīng) 1.5h MC-YR峰高明顯降低,說(shuō)明 USTB-05酶中存在能夠催化代謝 MC-YR的酶,另外在保留時(shí)間 5.5, 9.2min處分別出現(xiàn)了產(chǎn)物 1和產(chǎn)物 2的出峰.進(jìn)一步延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到3h,發(fā)現(xiàn)MC-YR峰消失,產(chǎn)物1峰降低,但在保留時(shí)間12.1min處出現(xiàn)了產(chǎn)物3的出峰.反應(yīng)3～24h,產(chǎn)物1和2的峰高逐漸降低并消失,而產(chǎn)物3的峰高逐漸增加.Bourne等[8,27]對(duì)鞘氨醇單胞菌的MC-LR和MC-RR降解途徑進(jìn)行了研究,首先第1個(gè)酶打開(kāi)連接Adda與精氨酸之間的肽鍵,催化環(huán)狀MC-LR和MC-RR變成線狀的MC-LR和MC-RR;然后第 2個(gè)酶進(jìn)一步斷裂線型 MC-LR和MC-RR肽鏈上丙氨酸與亮氨酸的肽鍵,生成四肽化合物;再經(jīng)第 3個(gè)酶降解為小分子多肽和氨基酸.并證明了這 3種代謝產(chǎn)物的毒性明顯低于MC-LR和MC-RR本身,降解過(guò)程是一個(gè)解毒的過(guò)程.本研究結(jié)果與Bourne等的研究結(jié)果相似,說(shuō)明USTB-05同樣至少有3種酶參與了MC-YR的催化降解反應(yīng),出現(xiàn)了3個(gè)降解產(chǎn)物,其中產(chǎn)物1和 2分別是由第 1個(gè)酶和第 2個(gè)酶催化降解MC-YR產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物,而產(chǎn)物3為第3個(gè)酶催化降解MC-YR產(chǎn)生的最終產(chǎn)物.3種代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)正在進(jìn)一步的研究和測(cè)定中.

本課題組曾經(jīng)分別研究USTB-05酶催化降解MC-RR和MC-LR,分別觀察到了2個(gè)中間代謝產(chǎn)物和 1個(gè)最終產(chǎn)物[27,34],與本研究的結(jié)果基本一致,說(shuō)明 USTB-05很可能以類(lèi)似的途徑對(duì)MC-YR進(jìn)行生物降解.盡管?chē)?guó)內(nèi)外在MC-RR和MC-LR降解途徑與分子機(jī)理方面有很多研究報(bào)道[8,15,28-29],但對(duì)于結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的MC-YR的生物降解途徑的文獻(xiàn)相對(duì)較少.本研究發(fā)現(xiàn),我國(guó)云南滇池水華藍(lán)藻中存在MC-YR,在USTB-05生物降解MC-YR產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定、基因克隆表達(dá)、降解途徑與分子機(jī)理方面還需進(jìn)一步研究.

圖5 USTB-05粗酶催化降解MC-YR的HPLC圖譜Fig.5 HPLC chromatograms of the enzymatic biodegradation of MC-YR by the crude enzymes of USTB-05

3 結(jié)論

3.1 采自云南滇池的藻樣細(xì)胞中 MC-YR、MC-RR和 MC-LR的含量分別為 0.16, 0.96,0.47mg/g.

3.2 在初始濃度分別為 19.5mg/L MC-YR、79.5mg/L MC-RR和43.6mg/L MC-LR下,鞘氨醇單胞菌USTB-05在2d內(nèi)可將上述3種MCs全部降解.鞘氨醇單胞菌USTB-05粗酶液可以以更快的速率對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品 MC-YR、MC-RR和MC-LR進(jìn)行高效酶催化降解,在10h內(nèi)可以將初始濃度分別為 14.8mg/L MC-YR、28.4mg/L MC-RR和19.5mg/L MC-LR全部降解.當(dāng)pH 值7.0和8.0中性偏堿時(shí),降解酶活性較高.

3.3 在USTB-05酶催化降解MC-YR過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)2個(gè)中間和1個(gè)最終代謝產(chǎn)物.

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Biodegradation of microcystins by Sphingopyxis sp. USTB-05.

XU Hui-min1, YAN Hai1?, MA Song1, WANG Hua-sheng1,2, YIN Chun-hua1, LIU Xiao-lu1
(1.School of Chemistry and Biological Engineering, University of Science and Technology, Beijing 100083, China；2.School of Architectural and Surveying and Mapping Engineering, Jiangxi University of Science and Technology, Ganzhou 341000, China). China Environmental Science, 2014,34(5)：1316～1321

The contents of microcystins (MCs) in dry cyanobacterial cells taken from Dianchi Lake and the biodegradation of MC-YR, RR and LR by Sphingopyxis sp. USTB-05 at the cellular and enzyme levels were studied. The contents of MC-YR, RR and LR in dry cyanobacterial cells were 0.16, 0.96 and 0.47mg/g, respectively. Initial concentrations of 19.5mg/L MC-YR, 79.5mg/L MC-RR and 43.6mg/L MC-LR were completely biodegraded by Sphingopyxis sp. USTB-05 within 2d. Further studies indicated that MC-YR, RR and LR could also be biodegraded in more rapid rates by crude enzymes of Sphingopyxis sp. USTB-05, and initial MC-YR, RR and LR of 14.8, 28.4, 19.5mg/L were completely removed within 10h, respectively, and two intermediate and one final products were found during the biodegradation process of MC-YR catalyzed by the crude enzymes of USTB-05.

microcystins；Sphingopyxis sp. USTB-05；enzyme；biodegradation

X172

A

1000-6923(2014)05-1316-06

2013-09-12

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21177009,11071013);教育部博士點(diǎn)基金資助項(xiàng)目(20120006110001)

? 責(zé)任作者, 教授, haiyan@ustb.edu.cn

徐慧敏(1989-),女,內(nèi)蒙古包頭人,北京科技大學(xué)碩士研究生,主要從事微囊藻毒素的生物降解研究.