單生苗 王建英 杜志強

（內(nèi)蒙古科技大學(xué) 數(shù)理與生物工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭014010）

布魯菌是造成布病的直接病原，可以使得人畜之間共患疾病，稱為布?。会槍@種二類傳染病，目前為止仍然沒有有效的疫苗。本文以豬型布魯菌的omp31基因與bls基因作為研究對象，通過基因的融合表達、蛋白純化、抗體制備與抗體質(zhì)量檢測等研究，試圖揭示布魯菌BLS分子增強蛋白質(zhì)抗原分子免疫刺激能力的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

rOmp31蛋白表達菌株、rOmp31-BLS融合蛋白表達菌株：試驗前期構(gòu)建，在實驗室低溫冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 重組蛋白的融合表達

將rOmp31蛋白表達菌株、rOmp31-BLS融合蛋白表達菌株過夜活化處理，之后利用新鮮LB液體培養(yǎng)基進行轉(zhuǎn)培養(yǎng)，再用IPTG進行誘導(dǎo)表達，表達結(jié)果用SDS-PAGE檢測[1]。

1.2.2 親和純化

誘導(dǎo)表達之后低速離心收集菌體，超聲波破碎菌體之后，高速離心收集上清液，rOmp31蛋白利用GST親和柱進行純化，rOmp31-BLS融合蛋白利用His-tag鎳柱進行親和純化[2]。

1.2.3 抗體制備

將純化后的rOmp31蛋白和rOmp31-BLS融合蛋白分別作為抗原免疫家兔，制備抗血清[3]。

1.2.4 抗體質(zhì)量檢測利用western blot檢測兩種抗體的質(zhì)量[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組rOmp31蛋白的誘導(dǎo)表達與純化結(jié)果

圖1的SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示：rOmp31蛋白被正確表達，圖示的蛋白大小與理論值55.3 kD一致。

圖1 布魯菌重組rOmp31的誘導(dǎo)表達與純化結(jié)果

2.2 rOmp31-BLS融合蛋白的誘導(dǎo)表達與純化結(jié)果

圖2的SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示：rOmp31-BLS融合蛋白被大腸桿菌正確表達，理論預(yù)測融合分子的分子量為49.4 kD，圖中條帶位置與其一致。

圖2 布魯菌rOmp31-BLS融合蛋白的誘導(dǎo)表達與純化結(jié)果

2.3 抗體質(zhì)量檢測結(jié)果

以等量的純化后的rOmp31蛋白和rOmp31-BLS融合蛋白作為western blot的蛋白質(zhì)樣品，進行電泳處理，轉(zhuǎn)膜后分別進行等量的對應(yīng)抗體的識別，從圖1右側(cè)和圖2右側(cè)的western blot顯色條帶來看：相同的抗體和等量的蛋白質(zhì)進行識別rOmp31-BLS融合蛋白產(chǎn)生了較粗的條帶，說明rOmp31-BLS融合蛋白刺激家兔產(chǎn)生的抗體的滴度要比rOmp31蛋白對應(yīng)的抗體的滴度要高。

3 討論

目前，關(guān)于布魯菌的蛋白亞單位疫苗研究的較為深入，主要集中在關(guān)于布魯菌的外膜蛋白質(zhì)的免疫原性研究方面。但是，Omp系列的外膜蛋白的免疫刺激能力有限，能夠成為亞單位疫苗的候選分子的Omp分子很少。因此，本論文以布魯菌的omp31抗原基因與bls基因作為研究對象，將omp31與bls基因進行融合表達，獲得多克隆抗體之后研究BLS分子的增強抗原分子免疫刺激能力的作用。試驗結(jié)果顯示：重組Omp31蛋白與BLS分子融合表達之后，免疫家兔產(chǎn)生的抗體的滴度有所提高，進一步加強了Omp31蛋白的免疫刺激作用。

［1］Du ZQ，Li XC，Wang ZH，et al.A single WAPdomain(SWD)-containing protein with antipathogenic relevance in red swamp crayfish，Procambarus clarkia[J].Fish Shellfish Immunol，2010，28(1)：134-142.

［2］Ren Q，Zhou J，Jia YP，et al.Cloning and characterization of Rap GTPase from the Chinese white shrimp Fenneropenaeus chinensis[J].Dev Comp Immunol，2012，36(1)：247-252.

［3］Du ZQ，Ren Q，Zhao XF，et al.A double WAP domain (DWD)-containing protein with proteinase inhibitory activity in Chinese white shrimp，F(xiàn)enneropenaeus chinensis[J].Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2009，154(2)：203-210.

［4］Li XC，Du ZQ，Lan JF，et al.A novel pathogen-binding gC1qR homolog，F(xiàn)cgC1qR，in the Chinese white shrimp,Fenneropenaeus chinensis[J].Dev Comp Immunol，2012，36(1)：400-407.