劉曉利，樊劍波，蔣瑀霽

(中國科學(xué)院南京土壤研究所，南京 210008)

廣西地處南亞熱帶，適合甘蔗生長，是我國重要的蔗糖生產(chǎn)基地。但廣西甘蔗單產(chǎn)較低，究其原因主要是土壤貧瘠、養(yǎng)分供應(yīng)不足、施肥不當(dāng)。土壤微生物是有機質(zhì)和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、循環(huán)的動力，在土壤肥力形成和發(fā)展的許多方面發(fā)揮著極其重要的作用［1］。而施肥又是影響土壤微生物數(shù)量及其多樣性的重要農(nóng)業(yè)措施［2］。施用有機肥料或?qū)嵭薪斩掃€田，可以顯著的提高土壤微生物數(shù)量，過量的施用NPK肥料，會降低土壤微生物多樣性［3］。同時，土壤理化性質(zhì)對微生物群落的影響在養(yǎng)分循環(huán)中發(fā)揮著重要的作用。土壤微生物也能夠迅速對周圍環(huán)境的變化做出反應(yīng)［4］。目前，研究施肥和土壤養(yǎng)分對微生物的影響已經(jīng)成為當(dāng)前土壤科學(xué)的研究熱點［5］。但廣西紅壤甘蔗生產(chǎn)過程中土壤微生物群落結(jié)構(gòu)是如何影響土地質(zhì)量和甘蔗產(chǎn)量的還未見相關(guān)深入研究報道。本文探討不同施肥制度對廣西甘蔗地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，旨在闡明不同施肥措施對甘蔗生產(chǎn)和維護土壤質(zhì)量的作用，進而選擇合理的施肥制度，為廣西紅壤地甘蔗生產(chǎn)提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1．1 試驗點基本情況

試驗地點位于廣西中南部南寧市武鳴縣鑼圩鎮(zhèn)，地處南寧市西北方向的武鳴盆地西部，地勢平坦寬闊，距離南寧市80km。屬亞熱帶季風(fēng)氣候，夏長冬短，霜雪少見，植物四季常綠，特別有利于發(fā)展亞熱帶果品作物。土壤類型為廣西典型的沙頁巖發(fā)育的赤紅壤。

地理坐標(biāo)為東經(jīng) 23°14'49″，北緯 108°2'50″，坡度為1/50，屬平原旱地類型。監(jiān)測點的年平均氣溫為21．5℃，1月平均氣溫為14．5℃，7月平均氣溫為28．8℃，年平均日照1660h，無霜期平均343d。年平均降雨量1100—1700mm，降雨量中夏季占45%，秋季占30%，春季占16%，冬季占9%。

甘蔗試驗區(qū)種植前土壤養(yǎng)分性狀如下:pH值5.68，速效磷 11．3mg/kg，速效鉀 123mg/kg。

1．2 試驗設(shè)計

試驗使用的肥料為尿素、鈣鎂磷肥和氯化鉀。氮肥和鉀肥分 3次施用，苗肥占 20%，分蘗肥占30%，伸長肥占50%，磷肥作苗肥一次性施用。各處理均設(shè)3次重復(fù)，小區(qū)規(guī)格為3m×8m，隨機區(qū)組排列，小區(qū)之間設(shè)置隔離田埂。甘蔗品種為新臺糖22號。各處理的肥料施用量見表1。甘蔗于2008年2月24日播種。

表1 各處理肥料施用情況表Table 1 The fertilization condition of different treatments

1．3 測試方法

試驗于2012年11月甘蔗收獲后田間采取土壤樣品。在距離地表0—20cm處取樣，每個小區(qū)取樣5個點的新鮮樣品混合。每個處理的3個取樣小區(qū)各取100g土在4℃條件下保存，一周后提取土壤DNA，測定土壤微生物多樣性。6個樣品依次標(biāo)記為:1(CK)、2(常規(guī)施肥)、3(優(yōu)化施肥)、4(增量施氮)、5(增量施磷)、6(蔗葉覆蓋)

1．3．1 土壤DNA提取、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和變性梯度凝膠電泳

(1)主要儀器和試劑

DGGE所用儀器為The DcodeTMUniversal Mutation Detection System(Bio-Rad Co．)，引物擴增16S rDNA V3高變區(qū)，引物為帶有GC夾子的357F GC和517R，其中 V357f2GC(5'2CGCCCGCCGCGC GCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACG GGAGGCAGCAG2

3)'，V517R(5'2ATTACCGCGGC TGCTGG23)'由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

(2)抽提土壤總DNA

DNA的提取參照 Miller［18］的方法，采用基因組DNA純化試劑盒(Fast DNA SPIN for Soil Kit)提取純化土壤中總基因組DNA，然后用1．0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。DNA的定量測定用紫外分光光度儀(日本島津UV21600)測量樣品在260 nm和310 nm的吸光值，然后根據(jù)公式計算DNA的濃度，計算公式為:根據(jù)公式計算DNA的濃度，計算公式為:

(3)PCR擴增

50μLPCR 體系:10×PCR buffer(含 Mg2+)5μL，脫氧核苷酸(dNTP)1μL，上游引物500nmol/L，下游引物500nmol/L，TaqDNA 聚合酶 2U，模版 10ng，最后加滅菌雙蒸餾水至50μL。

PCR反應(yīng)條件如下:95℃，預(yù)變性3min，然后加入Taq酶，35個循環(huán)為93℃1min，48℃1min，72℃1min 10s，最后在72℃下延伸5min;擴增后的 PCR產(chǎn)物用1．2%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量。

(4)變形梯度凝膠電泳(DGGE)

對于變性梯度從上到下是30%到70%，聚丙烯酰胺凝膠濃度是8%;在200V的電壓下，上樣量為13μL。其運行條件是:0．5×TAE電泳緩沖液，60℃電泳條件下，220V，12h，電泳完畢后，用0．8μg/mL的SYBRGREEN I染色20 min，再用去離子水漂洗。將染色后的凝膠用Bio-RAD的GelDoc-2000凝膠影像分析系統(tǒng)拍照;用 QuantityOne分析軟件(Bio-Rad)分析樣品電泳條帶，條帶的密度由該軟件自動算出。

1．3．2 土壤理化性質(zhì)分析方法

土壤含水量采用烘干法測定;土壤全氮采用半微量凱氏法，全磷采用氫氟酸-高氯酸消煮-鉬銻抗比色法，全鉀采用氫氟酸-高氯酸消煮-火焰光度法;堿解氮用堿解擴散法;速效磷用0．5 mol/L NaHCO3法;速效鉀用NH4OAc浸提-火焰光度法;緩效鉀采用硝酸浸提-火焰光度法;銨態(tài)氮和硝態(tài)氮分別采用氯化鉀浸提-靛酚藍比色法和酚二磺酸法測定。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同施肥制度對甘蔗地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

2．1．1 不同施肥制度土壤微生物群落DGGE圖譜分析

應(yīng)用DGGE技術(shù)分離16S rDNA V3片段PCR產(chǎn)物，可以看到分離為若干條帶(圖1)，但不同土壤樣品的16SrDNA V3片段PCR產(chǎn)物出現(xiàn)的帶型有一定差別，從16SrDNA V3片段PCR產(chǎn)物的DGGE圖譜進行初步統(tǒng)計發(fā)現(xiàn):在6種不同施肥處理下，DGGE圖譜中電泳條帶數(shù)目、強度和遷移率均存在差異，充分顯示了微生物多樣性在不同施肥處理間的差異。不同土壤間具有許多共同的條帶，說明這些供試土壤之間可能存在一些共有的細菌類型，然而這些公共條帶的亮度也不相同，表明土壤微生物在豐度上有明顯的改變。長期蔗葉覆蓋的土壤條帶數(shù)量相對其它土壤明顯多，說明微生物多樣性最高，而長期不施用化肥(CK)的土壤可見條帶數(shù)量相對其它土壤較少，說明其微生物多樣性較低。

圖1 16S r DNA V3片段PCR產(chǎn)物的DGGE圖譜以及泳道比較圖Fig．1 DGGE profile of am plified 16S rDNA fragments from soil sam p les and land com pare1—3:CK;4—6:常規(guī)施肥;7—9:優(yōu)化施肥;10—12:增量施氮;13—15:增量施磷;16—18:蔗葉覆蓋

2．1．2 不同施肥制度土壤微生物群落相似性分析

聚類分析(UPGMA)表明(圖2)，6種土壤樣品共分為兩大族群，空白和普通NPK施肥處理為一種族群，增施氮肥、增施磷肥、優(yōu)化施肥和蔗葉覆蓋為另一種族群。說明增量施用化肥肥料可能會改變土壤的細菌群落結(jié)構(gòu)，而長期普通化肥用量對土壤的細菌群落結(jié)構(gòu)影響不大。從相似性來看，優(yōu)化施肥和過量施入氮、磷養(yǎng)分處理土壤間的相似性比較大，達到了77%，各土壤之間的相似性都高于45．0%。

圖2 不同土壤微生物群落聚類分析Fig．2 DGGE Cluster analysis(UPGMA)of16S rDNA profiles of bacterial communities in soil samp les

2．2 不同施肥制度對甘蔗地土壤微生物多樣性指數(shù)的影響

不同施肥處理對甘蔗長期試驗地土壤微生物數(shù)量和種群均有一定影響，但未能發(fā)現(xiàn)明顯規(guī)律。其中，優(yōu)化施肥處理的 Simpson指數(shù)數(shù)值最高，Shannon-Wienner指數(shù)也顯示出了較高優(yōu)勢?？傮w說明，優(yōu)化施肥的養(yǎng)分配比較為合理，已經(jīng)足夠植物吸收利用，可以增加根系分泌物，提供土壤微生物更多的能源物質(zhì)，從而提高土壤微生物量［6］。Simpson指數(shù)與Shannon指數(shù)變化趨勢相似，隨著施肥量的增加，生物多樣性指數(shù)是增加的趨勢。

同時，蔗葉覆蓋處理的土壤微生物多樣性指數(shù)也較其他處理高，尤其是 Shannon-Wienner指數(shù)(圖3)。

圖3 不同施肥處理土壤微生物多樣性指數(shù)(Shannon-Wienner，Simpson)Fig．3 The Shannon-W ienner and Sim pson indexs in long-term different fertilization system s

2．3 不同施肥制度甘蔗地土壤養(yǎng)分對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

2．3．1 土壤全量氮、磷、鉀對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

土壤全氮和全磷含量與微生物群落結(jié)構(gòu)關(guān)系密切，全磷含量對土壤微生物群落無顯著影響(圖4)。說明，甘蔗地長期施用氮肥和鉀肥可以促進微生物活性，優(yōu)化施肥要注重氮、鉀肥的穩(wěn)定投入。

圖4 土壤全量氮、磷、鉀含量與微生物群落結(jié)構(gòu)關(guān)系Fig．4 The correlation between total N、P、K content and soil m icrobial structure

2．3．2 土壤速效養(yǎng)分對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

從土壤養(yǎng)分與微生物群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性來看，速效鉀＞速效磷＞堿解氮＞緩效鉀(圖5)。有研究表明［7］，土壤中有效鉀的變化與土壤中微生物群落的變化有很大關(guān)系，造成在鉀礦脅迫堆肥中含有大量的微生物，尤其是土壤中對鉀礦有一定降解作用的硅酸鹽細菌。微生物在土壤中的大量繁殖加速了土壤中鉀素的循環(huán)，使土壤中有效鉀的含量大量增加，而供鉀效果最差的緩效鉀與土壤微生物群落形成無顯著相關(guān)。

圖5 土壤速效氮、磷、鉀含量與微生物群落結(jié)構(gòu)關(guān)系Fig．5 The correlation between available N、P、K content and soilm icrobial structurea．速效氮;b．速效磷，c．速效鉀;d．緩效鉀

2．3．3 土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和含水量對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

土壤銨態(tài)氮對微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著影響，可以促進微生物群落的發(fā)展。銨態(tài)氮的施入會降低土壤pH值，使得甘蔗根際微生物環(huán)境發(fā)生變化(圖6)。

土壤有效性水分是微生物活性的重要資源，土壤水分能為細菌運動提供介質(zhì)，土壤含水量降低到一定程度時，引起土壤水對微生物的生理脅迫［8］。土壤水分的變化對活躍的微生物群落影響較大，水分含量過低會導(dǎo)致微生物數(shù)量會大幅度減少［9-10］。

圖6 土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、含水量與微生物群落結(jié)構(gòu)關(guān)系Fig．6 The correlation between the content of ammonium nitrogen， nitrate nitrogen， soil water and soil m icrobial structure

3 討論

3．1 不同施肥制度對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)相似性的影響

從微生物群落相似性來看，優(yōu)化施肥和過量施入NPK肥處理土壤間的相似性達到了77%，不同施肥制度改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，這與Donnell［11］等和 Kinura［12］等報道相同。Gelsomino［13］對兩種粉沙壤土和15種其它土壤的研究表明了相同的土壤具有更為相似的微生物結(jié)構(gòu)。不同的長期施肥措施雖然沒有影響土壤質(zhì)地的變化，但會導(dǎo)致有機碳含量和其它理化性質(zhì)的改變，從而改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。Marschner［14］等認為不同處理間土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性或多樣性變化主要是由于土壤微域生境的改變所致，這種改變影響了土壤生境對多種微生物的適宜性。

3．2 不同施肥制度對土壤微生物多樣性的影響

推薦施肥處理的Shannon-Wienner指數(shù)數(shù)值最高，說明該施肥水平下土壤微生物種類最多。以該地塊為研究對象的試驗結(jié)果表明，優(yōu)化施肥處理的氮、磷施用量是充足的，增加了土壤微生物肥力，甘蔗產(chǎn)量比常規(guī)施肥增產(chǎn)甘蔗 4．0%—7．78%。長期NPK化肥均衡施用，比非均衡施肥處理的農(nóng)田增加了驅(qū)動CNPS養(yǎng)分循環(huán)的功能微生物的數(shù)量，同時增加了蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸單酯酶等土壤酶的活性，使宿根蔗土壤酶活性趨于向高活性方向轉(zhuǎn)化［15-16］。蔗葉覆蓋處理微生物多樣性指數(shù)較高，這主要是由于蔗葉覆蓋土壤中細菌的數(shù)量明顯增加，蔗葉覆蓋減少了土壤水分的蒸發(fā)，提高土壤溫度，又有良好的保水性，有利于菌類的生長，刺激了細菌數(shù)量的增加［17］。施用有機肥在不同程度上提高了微生物整體功能活性和豐富度，但降低了微生物群落的均勻度［18］。有機肥的施用也改善了土壤微生態(tài)結(jié)構(gòu)，促進了土壤有益微生物增長，提高了土壤微生物多樣性和改善了土壤質(zhì)量［19］。由于蔗葉還田處理對土壤理化性狀和微生物的影響仍需要較長時間才能全面深入的反映出來，因此，還需要繼續(xù)長期定位試驗來探討不同施肥措施對微生物群落影響的機制［20］。后續(xù)本試驗也將繼續(xù)通過高通量測序的先進方法，進一步系統(tǒng)闡明功能群落(如氨氧化微生物，解磷菌等)和優(yōu)勢種群的變化特征。

3．3 土壤養(yǎng)分對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

本研究中土壤氮素和鉀素對微生物群落結(jié)構(gòu)影響較大，施磷使土壤磷濃度明顯增加，但對土壤生物數(shù)量的影響卻不明顯，有研究結(jié)果表明，草地土壤中磷素也不是影響土壤微生物的主要因素［21］。施氮會引起土壤群落生物量的明顯增加，土壤中的N元素被微生物吸收利用后，在體內(nèi)用于合成具有重要生理作用的蛋白質(zhì)、核苷酸等生物大分子［22］。因此，土壤中N元素不足將嚴重限制土壤微生物的正常生長和活性。也有研究表明，氮肥的過量施入會影響甘蔗出苗情況，合理施用氮肥才是甘蔗高產(chǎn)的有效途徑之一［23］。不同氮肥形態(tài)對根際微生物具有顯著影響［15］，氮肥的增加可引起根系分泌物的改變，銨態(tài)氮肥使根際微生物吸入胸腺嘧啶的量減少，根際pH值下降［24］。土壤中硝態(tài)氮含量對土壤微生物群落的恢復(fù)起到了關(guān)鍵作用［25］，通常N源易利用大小順序為:銨態(tài)氮＞硝態(tài)氮＞有機氮。

4 結(jié)論

4．1 不同施肥制度改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)

不同施肥處理對甘蔗地土壤微生物群落均有一定影響，不施肥甘蔗地土壤細菌條帶數(shù)較少，微生物豐度較低，長期施肥后可提高土壤微生物多樣性。常規(guī)施肥的微生物多樣性低于優(yōu)化施肥和增量施肥等處理。同一母質(zhì)土壤存在一些共有的細菌類型，因不同施肥處理，影響土壤全氮、磷、鉀和其他理化性質(zhì)的改變，進而改變了微生物群落結(jié)構(gòu)。

4．2 土壤氮、鉀養(yǎng)分顯著影響微生物群落結(jié)構(gòu)

微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤總N、總K密切相關(guān)，與全P無顯著相關(guān)。同時，如果N源不足將嚴重限制土壤微生物的正常生長和活性，其中銨態(tài)氮是最易被利用的。因此，可在甘蔗地適當(dāng)增加氮肥用量來提高微生物活性，從而提高土壤肥力和甘蔗產(chǎn)量。速效鉀含量對土壤微生物群落形成的作用顯著，微生物對鉀的釋放也會提供作物可吸收的有效鉀養(yǎng)分。因此，可選擇在甘蔗地適當(dāng)增加鉀肥用量用以提高微生物群落多樣性，提供土壤生物肥力。

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