徐洪衛(wèi)，張晨光，金 磊

(1.徐州醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，江蘇徐州221004;2.徐州醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，江蘇徐州221004)

分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)滲透到醫(yī)學(xué)科研的各個(gè)領(lǐng)域，在分子生物學(xué)技術(shù)中，總RNA的提取是一項(xiàng)基礎(chǔ)性工作，能否獲得高質(zhì)量的RNA，是決定后續(xù)試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵因素之一［1－2］。TrizoI法提取總RNA是一種傳統(tǒng)經(jīng)典的方法，目前廣泛運(yùn)用于分子生物學(xué)試驗(yàn)，其原理是TrizoI中的異硫氰酸胍可使核蛋白體裂解，使RNA與蛋白質(zhì)分離，釋放入液相，而氯仿可提取TrizoI中苯酚，從而使苯酚中總RNA進(jìn)入水相，經(jīng)離心、純化得到總RNA［3］，而UNIQ-10柱式總RNA抽提法(以下簡(jiǎn)稱柱式法)主要利用堿基配對(duì)原理，采用寡聚T結(jié)構(gòu)作為親和柱材料，當(dāng)總RNA流經(jīng)寡聚T柱時(shí)，RNA即被特異結(jié)合到柱子上，從而達(dá)到分離提取的目的［4］。筆者采用柱式法與Trizol法分別從大鼠晶狀體中提取總RNA，使用NanaDrop2000測(cè)定其濃度及A260/A280、A260/A230，瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)分析提純樣品，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR，以下簡(jiǎn)稱RT-PCR)檢測(cè)是否可用于下游試驗(yàn)［5－6］，客觀評(píng)述此2種方法優(yōu)缺點(diǎn)，為科研及教學(xué)提供合適的總RNA抽提方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 Sprague-Dawley(SD)大鼠，清潔級(jí)，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將大鼠斷頭處死，取出晶狀體置于無(wú)菌、無(wú)核酶1.5 ml離心管中，于－80℃凍存。

1.2 主要儀器 小型高速離心機(jī)、電子天平、高壓滅菌鍋、電子天平、電泳槽、超凈工作臺(tái)、NanaDrop2000、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、PCR儀等。

1.3 試劑及配制 ①1 kb DNA ladder購(gòu)買(mǎi)于NEB公司，RT-PCR System、agarose購(gòu)買(mǎi)于promega公司，UNIQ-10柱式總RNA抽提試劑盒、Trizol總RNA抽提試劑盒、特異性引物購(gòu)買(mǎi)于生工(上海)生物工程有限公司，無(wú)水乙醇、氯仿、異丙醇均為國(guó)產(chǎn)試劑。②1%DEPC:DEPC 1 ml，加入1 L滅菌蒸餾水中，劇烈振蕩后室溫靜置數(shù)小時(shí)。③TBE緩沖液:稱取Tris12.1 g，硼酸5.3 g，DETA 0.74 g，溶于蒸餾水中，再定溶至1 000 ml。④試劑分裝:無(wú)水乙醇、氯仿、異丙醇按照2 ml分裝至無(wú)菌、無(wú)核酶EP管中。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 柱式法抽提總RNA。將凍存于－80℃的大鼠晶狀體取出(約50 mg)，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌勻漿器中，立即加入450 μl RLT Solution，手動(dòng)勻漿處理，勻漿時(shí)間不超過(guò)1 min。其余標(biāo)準(zhǔn)操作步驟參見(jiàn)操作手冊(cè)。

1.4.2 Trizol法抽提總RNA。將凍存于－80℃的大鼠晶狀體取出(約50 mg)，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌勻漿器中，立即加入1 ml TotalRNAExtractor，手動(dòng)勻漿處理，勻漿時(shí)間不超過(guò)1 min。其余標(biāo)準(zhǔn)操作步驟參見(jiàn)操作手冊(cè)。

1.4.3 RNA的瓊脂糖凝膠電泳。①電泳RNA所用器械:凝膠槽、梳子、電泳槽等經(jīng)常規(guī)洗凈后，用乙醇脫水，再浸泡于3%H2O2溶液中10 min，然后用0.1%DEPC處理水徹底沖洗，室溫晾干備用。②1×TBE緩沖液、上樣緩沖液用經(jīng)DEPC處理過(guò)的滅菌蒸餾水配制，然后用0.22 μm濾器過(guò)濾除菌。③用1×TBE緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠，GelRed(10000×)加入凝膠中混勻再倒膠至凝膠槽中制膠。④制備好的瓊脂糖凝膠板放入電泳槽后再加入1×TBE，液面淹沒(méi)過(guò)膠1～2 mm。⑤電泳電壓2.5 V/cm，時(shí)間30 min，紫外燈下觀察結(jié)果并進(jìn)行拍照。

1.4.4 一步法RT-PCR。反應(yīng)體系:用50 μl RT-PCR體系，RNA 模版加入 3 μl，特異性引物濃度 1 μmol/L，dATP、dTTP、dGTP、dCTP濃度各為2 μmol/L，反轉(zhuǎn)錄酶與DNA聚合酶均為2.5 U。反應(yīng)條件:反轉(zhuǎn)錄48℃ 45 min，預(yù)變性94℃ 2 min;變性94℃ 1 min、退火58℃ 1 min、延伸72℃ 1 min，25個(gè)循環(huán);最后延伸為72℃ 5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 柱式法及Trizol法抽提總RNA結(jié)果 使用柱式法及Trizol法提取總RNA結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，28S和18S亞基清晰可見(jiàn)，RNA降解較少，用NanaDrop2000測(cè)定RNA濃度，A260/A280、A260/A230結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，柱式法A260/A280、A260/A230均在1.8 ～2.0，說(shuō)明蛋白質(zhì)及碳水化合物的污染較少。而使用Trizol法提取總RNA降解較多，其中28S亞基檢測(cè)不到，A260/A230很低說(shuō)明在提取過(guò)程中受到了污染或者是苯酚及乙醇?xì)埩簟ｋ娪咀钋岸丝梢?jiàn)較多降解條帶。

圖1 總RNA抽提結(jié)果

表1 2種方法提純RNA結(jié)果

2.2 RT-PCR 分別使用柱式法及Trizol法抽提的總RNA為模板，RT-PCR方法構(gòu)建大鼠晶狀體蛋白βB2，RT-PCR系統(tǒng)中除模板不同，其余成分完全一致，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，使用柱式法抽提的總RNA為模板進(jìn)行的RT-PCR反應(yīng)有一清晰可見(jiàn)的亮帶，其大小與目的基因大小(711 bp)吻合，證明是目的基因。而使用Trizol抽提的總RNA為模板進(jìn)行的RT-PCR反應(yīng)無(wú)結(jié)果，說(shuō)明此模板不能進(jìn)行RTPCR試驗(yàn)。這與之前分析的總RNA質(zhì)量相吻合。

3 討論

圖2 RT-PCR結(jié)果

Trizol法提取總RNA耗時(shí)稍長(zhǎng)，約70 min，需要冷凍離心機(jī)，部分操作過(guò)程需要在冰浴中切，容易受到苯酚污染及乙醇?xì)埩簦虼藢?duì)操作要求較高，但Trizol法提取大量樣本時(shí)較為方便，適合大量樣本的總RNA提取，且可以將總RNA保存在純化的中間步驟乙醇中，待試驗(yàn)需要時(shí)再進(jìn)一步純化，對(duì)于樣品的存儲(chǔ)較為有利，存儲(chǔ)時(shí)間更長(zhǎng)。柱式法提取總RNA對(duì)于試驗(yàn)條件的要求相對(duì)較低，操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，約40 min，全程可在常溫下進(jìn)行，不需要冷凍離心機(jī)，樣品純度較高，不易受到苯酚污染及乙醇?xì)埩簦绻枰崛〈罅繕悠?，則需要使用多只純化柱分別操作，給操作帶來(lái)很大不便。

總RNA提取極易受到操作方法不當(dāng)及外部環(huán)境的影響而發(fā)生降解［7－9］，造成RNA降解的原因來(lái)自內(nèi)因和外因2個(gè)方面。內(nèi)因是細(xì)胞破碎瞬間內(nèi)部RNA酶釋放對(duì)RNA的降解作用。外因是生物體內(nèi)和外部環(huán)境中存在大量RNA酶，且RNA酶不易失活，高溫后仍能正確折疊恢復(fù)活性［10］。因此從樣品的儲(chǔ)存、RNA的提取以及RNA提取完成后的保存，都需要充分準(zhǔn)備，防止RNA酶對(duì)RNA的降解。在具體試驗(yàn)過(guò)程中，需要注意兩點(diǎn)，其一，抑制外源性RNA酶活性，在操作過(guò)程中創(chuàng)造一個(gè)無(wú)RNA酶的環(huán)境，對(duì)操作過(guò)程中所有試驗(yàn)材料進(jìn)行徹底處理，滅活RNA酶。其二，抑制內(nèi)源性RNA酶活性，使用RNA酶特異性抑制劑如巰基乙醇等，RNA酶抑制劑對(duì)其他核酸工具酶無(wú)影響，其中關(guān)鍵操作步驟在于勻漿是否快速、徹底。

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