鄧 歡 賴 星 孫志洪 陳 澄 石寶石 唐志如

(西南大學動物科技學院，生物飼料與分子營養(yǎng)實驗室，重慶 400715)

1917年，志賀菌痢爆發(fā)，德國醫(yī)生 Alfred Nissle從疫區(qū)一位未患腸炎的士兵糞便中分離了1株無致病性的大腸桿菌(E.coli)菌株，命名為 E.coli Nissle1917(EcN)。隨后，科學家分離到一些新的益生E.coli菌種，如 SK22(保存于德國菌種中心，編號為DSM6601)，并探索了它們對動物健康的益生機理［1-2］。作為一種腸道微生物，EcN能定植于腸道中并與其他微生物抗衡。了解EcN特殊的表型、定植機理、免疫調節(jié)機理和在仔豬方面應用的研究現(xiàn)狀對其他益生革蘭氏陰性桿菌在腸道中的研究具有重要參考意義。

1 EcN的基本特征

在瓊脂固體營養(yǎng)培養(yǎng)基上，EcN菌落呈半粗糙型，較光滑、透明、黏稠，易挑取，大而平坦，菌落正反面或邊緣與中央部位的顏色一致。EcN的O6抗原聚合酶wzy基因終止子上的點突變使得O6抗原多糖側鏈很短，由單個寡糖骨架“重復單位”組成O6抗原，其低聚糖骨架直接與“重復單位”相連，而不與長鏈多糖相連［3］。這種古怪脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)結構決定了 EcN的菌落半粗糙表型(圖1)，又稱為半粗糙 O6-LPS表型。這種表型決定了EcN的血清敏感性和免疫調節(jié)性［4］。EcN具有K5型莢膜(圖1)，在與腸上皮細胞相互作用時，K5型莢膜產生特異性趨化因子反應［4］。EcN基因組編碼F1A、F1C和卷曲菌毛(圖1)，這3種菌毛替代了P-和S-菌毛(具有血凝反應因子，是致病大腸桿菌代表性特征)［4-5］。

雖然EcN血清型為 O6∶K5∶H1，但無致病性。而與尿道感染相關的大腸桿菌菌種血清型也為O6∶K5∶H1，卻具有致病性。原因在于EcN基因組缺少其他大腸桿菌的毒力因子致病基因［3］。EcN適應性因子位于基因組的4個染色體組小島上，有助于定植于宿主(圖1)。

EcN最大的特點是具有獲取鐵營養(yǎng)素的多重機制(圖1)。EcN的6種鐵攝取系統(tǒng)能產生鐵螯合劑腸菌素、桿菌素、產氣菌素、鐵攝取有關氣菌素、枸櫞酸鐵運輸系統(tǒng)和儲血紅素運輸場所，有利于其利用環(huán)境中的 Fe3+［3，6］。EcN 具有氯高鐵血紅素和檸檬酸鹽依賴性鐵攝取系統(tǒng)［7］。EcN能產生EfeU［一種氧化酶依賴性鐵轉運(OFeT)家族的亞鐵系統(tǒng)攝取系統(tǒng)］［8］。EcN也能分泌小菌素M、小菌素H47、溶血素和細胞毒素壞死因子，從而抑制致病微生物［9］。

圖1 EcN的表型特征及其在基因組上的位置Fig.1 Phenotypical characteristics of EcN and its location in genome［3］

2 EcN的益生機理

2.1 EcN在腸道中的定植機制

EcN表達3種菌毛有利于其定植于腸上皮細胞，形成生物被膜，最終形成自然屏障來抵御致病菌的入侵［4-5］。EcN的K5型莢膜對黏附和定植起重要作用(圖 2)［10］。K5不產生血清抗性，同時EcN在血清抗性試驗中很快被殺死［11］。EcN表達的K5型莢膜能在腸上皮細胞和體內鼠小腸中激活Toll樣受體5(TLR5)產生化學增活素［12-13］。

EcN特有的6種鐵攝取系統(tǒng)有利于其在腸道中定植。EcN能提高豬的小腸鈣網(wǎng)蛋白(calprotectin)，這提示了鈣網(wǎng)蛋白可能在EcN的益生作用中發(fā)揮了作用［14］。EcN能促進炎癥腸道中抗菌的脂質運載蛋白-2(lipocalin-2)和鈣網(wǎng)蛋白高表達，但EcN的定植和益生功能是否增強有待進一步研究。高親和力金屬運載體可以增強EcN在炎癥的腸道中的定植力，并為其與包括病原菌在內的其他微生物之間競爭提供手段。

研究發(fā)現(xiàn)EcN能分泌抵抗菌物質(小菌素H47和小菌素M 等)來抵抗病原體［15］。小菌素是一種低分子質量的抗菌肽，類似于革蘭氏陽性桿菌的細菌素，對于補償免疫蛋白不足的細菌在種族發(fā)育中發(fā)揮了有力的殺菌作用［15］。小菌素H47和小菌素M與鐵螯合劑salmochelin結合，并為受體所感應，從而展示一種進入菌體的“Trojan horse”機制(圖 2)［6，16］。因此小菌素 H47 和小菌素M可增強EcN與腸道中其他微生物之間的競爭力。

圖2 益生菌EcN所具備的多種適應性因子Fig.2 The multiple fitness factors of probiotic EcN［16］

2.2 提高黏膜屏障

EcN通過鞭毛蛋白經(jīng)核轉錄因子-κB(NF-κB)和AP-1-依賴性途徑產生人抗菌肽β-防御素2(β-defensin 2)，從而增強結腸上皮細胞化學防御(圖 3)［14，17-18］。通過上調腸上皮細胞緊密連接蛋白 ZO-2水平，EcN 能提高黏膜屏障(圖 3)［19］。EcN能阻礙致腸病的大腸桿菌感染引起ZO-2表達下降。EcN通過上調閉鎖小帶(OZ-1、OZ-2)的表達，增強腸上皮細胞的緊密連接，減少因為腸漏引起的細菌異位與代謝產物穿過腸上皮細胞［20］。

2.3 調節(jié)致炎和抗炎細胞因子之間的平衡

EcN能下調炎癥，研究發(fā)現(xiàn)EcN具有調節(jié)致炎和抗炎的局部細胞因子的平衡(圖3)［21-22］。體外試驗表明，EcN的生物學功能與在腸道微生物的調控和腸內細胞因子引起免疫反應相關聯(lián)［23］。EcN抑制炎癥反應維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)的機理之一在于EcN能通過激活T細胞誘導天生性和記憶性外周血CD4+T細胞同源細胞的生長(圖3)［24］。EcN也能加速γδT細胞周期和細胞因子分泌(圖3)。γδT細胞的激活和脫噬作用是限制腸道炎癥的一種可能方式［25］。在變應原誘導的Th2反氣管炎癥，EcN被發(fā)現(xiàn)通過誘導不產生免疫球蛋白E(IgE)的 Th1模型來減輕癥狀［26］。許多研究發(fā)現(xiàn)，EcN通過提高分泌型免疫球蛋白A(sIgA)［2］，改變致炎和抗炎細胞因子［27-28］及調節(jié)T細胞的分化［29］來進行免疫調控。EcN能減少試驗小鼠大腸桿菌數(shù)量，降低通過 Toll樣受體 4(TLR4)和TLR5產生的炎癥細胞因子和干擾素-γ(IFN-γ)(圖3)［30］?？诜﨓cN能產生黏膜特異性免疫球蛋白G(IgG)與免疫球蛋白M(IgM)抗體而誘導嬰兒體液免疫(圖3)［31］。EcN的免疫調控作用也被發(fā)現(xiàn)在結腸上皮細胞，EcN提取物能促進細胞白介素-8(IL-8)的分泌［2］，降低結腸致癌指示物環(huán)氧酶-2(COX-2)和前列腺素E2(PGE2)的表達水平(圖 3)［32］。

3 EcN在仔豬方面的應用現(xiàn)狀

3.1 在腸道黏膜屏障方面

Kleta等［33］從仔豬腸內容物中篩選到EcN，證實了EcN也存在于豬小腸中，表明EcN是豬腸道微生物的一部分。同時Kleta等［33］研究了EcN對仔豬腸相關淋巴組織的影響，試驗中采用109和1011CFU/d EcN飼喂仔豬21 d，定量分析了腸免疫細胞(粒性白細胞、肥大細胞 CD4+、CD8+、CD25+、IgA+淋巴細胞)的數(shù)量和分布及黏膜細胞因子［IFN-γ、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉化生子因子-β(TGF-β)、細胞白介素-10(IL-10)］和抗菌肽 (PR-39、NK-lysin、pre-defensin-β1、protegrins)mRNA的表達水平，結果表明，各組中腸免疫細胞(粒性白細胞、肥大細胞 CD4+、CD8+、CD25+和IgA+淋巴細胞)的數(shù)量和分布小腸與結腸存在較大的差異，低劑量EcN各組間差異不顯著，高劑量EcN(1011CFU/d)使結腸升段黏膜CD8+細胞數(shù)量顯著增加。mRNA分析表明，飼喂EcN對黏膜細胞因子(IFN-γ、TNF-α、TGF-β、IL-10)和抗菌肽(PR-39、NK-lysin、pre-defensin-β1、protegrins)mRNA的表達水平無顯著影響，EcN對健康仔豬腸免疫細胞的分布影響較小。EcN的預防作用可能與除腸免疫細胞的分布的單一調節(jié)以外的其他機制有關。仔豬口服109CFU/d的EcN不會引起小豬結腸炎和泌尿生殖器感染［34］。唐志如等［35］研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌Abbottstown攻毒的斷奶仔豬中，口服1010CFU/d的EcN顯著下調空腸黏膜雙鏈RNA依賴的蛋白質激酶(PKR)、真核生物翻譯起始因子5A(eIF-5A)和TLR2 mRNA相對表達豐度，顯著降低空腸黏膜淋巴細胞數(shù)量，顯著提高空腸黏膜occludin蛋白水平，顯著上調空腸黏膜胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、肝細胞生長因子(HGF)、三葉草肽-3(TFF-3)和表皮生長因子(EGF)mRNA相對表達豐度，提示EcN能維持腸道功能完整性，并保護腸道屏障。

圖3 益生菌EcN對宿主免疫系統(tǒng)的調節(jié)途徑Fig.3 The probiotic EcN modulates the host immune system in multiple ways［31］

3.2 在促進生長與治療腹瀉方面

EcN對傳染性腹瀉具有良好的治療效果。Duncker等［36］對EcN預防21日齡斷奶仔豬急性分泌性腹瀉進行研究，試驗分為以下4組:1組［-腸毒性大腸桿菌(EcA)/-EcA，n=6］、2組(-EcN/+EcA，n=7)、3 組(+EcN/-EcA，n=4)和4組(+EcN/+EcA，n=4);將 1010CFU/d EcA 和EcN通過口胃管飼喂21日齡斷奶仔豬，攻毒48 h后，屠宰取空腸上皮置于Ussing chambers上測定空腸上皮電生理的參數(shù)的變化，結果表明，EcN預處理后的仔豬能完全控制仔豬急性分泌性腹瀉。唐志如等［35］研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌Abbottstown攻毒的斷奶仔豬中，口服1010CFU/d的EcN能顯著降低腹瀉率，顯著改善生長性能。Splichalova等［37］研究發(fā)現(xiàn)，豬感染沙門氏菌后血漿中 IL-10、TNF-α和腸道TNF-α濃度顯著增加，但在感染沙門氏菌前口服 EcN，血漿中IL-10、TNF-α和腸道TNF-α濃度無顯著影響，這提示了EcN能競爭性阻礙沙門氏菌的入侵。Schroeder等［38］研究表明提前口服EcN能預防斷奶仔豬受產毒型大腸桿菌的感染。

4 小結

EcN由于其特殊的基因型，決定了其半粗糙O6-LPS 表型、O6∶K5∶H1F1A 的血清型、特殊的菌毛與莢膜、適應性因子和鐵攝取系統(tǒng)，從而使得EcN在腸道中具有穩(wěn)定定植機制和免疫調節(jié)功能。以仔豬為對象的研究發(fā)現(xiàn)口服EcN能維護腸道形態(tài)結構，提高腸黏膜緊密連接性，維持腸道功能完整性，保護腸道屏障，進而提高斷奶仔豬生長性能和降低斷奶仔豬腹瀉率。

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