文│張晶 陳奎春 溫富勇 趙海明 張利娟（北京市密云縣農(nóng)業(yè)局 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市奶牛創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)）

目前北京市密云縣大多數(shù)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)奶牛妊娠診斷還采用傳統(tǒng)的配種后60天進(jìn)行直腸觸診法，既浪費(fèi)人力物力，又增加牛與人之間疾病的傳播。2014年4月密云縣引進(jìn)了先進(jìn)的奶牛早期妊娠診斷技術(shù)，使用“28天可視孕檢試劑盒”，對(duì)配種后28天的奶牛采血樣分離血清進(jìn)行診斷，該技術(shù)將奶牛妊娠診斷時(shí)間提前了30天，一頭奶牛可節(jié)省30天的飼養(yǎng)成本，增加奶產(chǎn)量，節(jié)約飼料成本，降低了產(chǎn)犢間隔，改善繁殖狀況，并減少對(duì)妊檢人員身體的傷害，避免了人畜傳染病的發(fā)生。目前，該項(xiàng)技術(shù)已在密云縣7個(gè)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行應(yīng)用，特異性達(dá)到了96%以上。本文簡(jiǎn)述了通過(guò)對(duì)懷孕奶牛早期產(chǎn)生相關(guān)糖蛋白的檢測(cè)，來(lái)判定奶牛是否妊娠的早期診斷方法的操作及對(duì)養(yǎng)牛業(yè)應(yīng)用的意義。

表1 早期妊娠診斷技術(shù)的準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)

一、奶牛早期妊娠診技術(shù)的意義和原理

1.奶牛早期妊診斷的意義。目前，密云縣共有奶牛場(chǎng)31家，共有7家使用此項(xiàng)技術(shù)，2013年以前密云地區(qū)大多數(shù)牛場(chǎng)使用的妊娠診斷方法都是直腸觸診法，既浪費(fèi)人力物力，又增加牛與人之間疾病的傳播。

對(duì)牛精準(zhǔn)及時(shí)的懷孕檢測(cè)在當(dāng)今的牧場(chǎng)繁殖管理程序中是一項(xiàng)十分重要的內(nèi)容。獸醫(yī)和牧場(chǎng)工作人員對(duì)牛進(jìn)行早期懷孕檢測(cè)，查找出空懷牛，這樣可以盡快重配空懷牛以及縮短產(chǎn)犢間隔，從而為奶牛場(chǎng)帶來(lái)最高的牛奶產(chǎn)量和收益。

傳統(tǒng)上，通過(guò)對(duì)牛進(jìn)行直腸觸診或超聲來(lái)診斷牛是否懷孕，一般45～60天以后才能監(jiān)測(cè)出結(jié)果。早期妊娠診斷技術(shù)，可以早在配種后28天就檢測(cè)到牛是否懷孕，特異性在96%～99%，該診斷方法為獸醫(yī)和奶牛場(chǎng)的工作人員提供了檢測(cè)懷孕牛的重要工具，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)很大的經(jīng)濟(jì)效益。以1000頭規(guī)模的奶牛場(chǎng)為例，泌乳牛繁殖率可從75%提高到80%，產(chǎn)間距可以從16個(gè)月下降到15個(gè)月，空懷天數(shù)可以下降30天，即1000頭×30天×30元/天＝900000元，將牛群空懷天數(shù)下降30天，可以為牧場(chǎng)帶來(lái)90萬(wàn)元的效益。

表2 久興奶牛場(chǎng)試驗(yàn)應(yīng)用情況

2.早期可視孕檢的原理。早期可視孕檢試劑盒是根據(jù)酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理設(shè)計(jì)的，用于檢測(cè)懷孕早期存在于牛血清的懷孕相關(guān)蛋白（PAGs），這類蛋白可以作為牛懷孕的標(biāo)志。微孔板已經(jīng)包被PAG抗體，將待檢樣品在包被板上進(jìn)行稀釋并孵育后，捕獲到的懷孕相關(guān)蛋白（PAGs）可以與特異性的PAG抗體（檢測(cè)溶液）和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物（酶標(biāo)抗體）結(jié)合。未被結(jié)合的酶標(biāo)抗體則被洗掉，隨后在孔內(nèi)加入TMB底物溶液?？變?nèi)溶液的顏色深淺與樣品中PAG的含量成比例。

二、此項(xiàng)技術(shù)在密云地區(qū)奶牛場(chǎng)的應(yīng)用

1.技術(shù)操作過(guò)程及要求。

（1）采取配種后28天以上奶牛的血樣。對(duì)配種28天以上奶牛的血樣進(jìn)行分離血清，已備檢測(cè)。

（2）試驗(yàn)操作程序。

第一步，試劑準(zhǔn)備。

在使用之前，所有的試劑盒組分都必須恢復(fù)到18～26℃。試劑應(yīng)通過(guò)輕輕渦旋、旋轉(zhuǎn)混合均勻。每個(gè)樣本都使用不同的吸頭。濃縮洗滌液要使用蒸餾水或去離子水進(jìn)行10倍稀釋。

第二步，在酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（ELISA）板中加入樣品及試劑。

在所有樣品和對(duì)照孔內(nèi)滴加一滴樣品稀釋液。使用試劑盒內(nèi)提供的移液器和附帶的吸頭，吸取陰性對(duì)照并分別加入兩個(gè)孔內(nèi)。吸取陽(yáng)性對(duì)照并分別加入兩個(gè)孔內(nèi)。吸取樣品（血清）并加入適當(dāng)孔內(nèi)。不同樣品需更換吸頭。輕彈微量反應(yīng)板將反應(yīng)板中的溶液混勻，蓋好蓋板，在18～26℃條件下孵育30分鐘（可以有誤差2分鐘）。洗板：移除蓋板，快速翻轉(zhuǎn)反應(yīng)板，將板孔內(nèi)液體棄入廢液缸或水槽。用裝有洗滌溶液的洗瓶洗板3～5次。每次洗滌后快速翻轉(zhuǎn)反應(yīng)板，棄去洗滌溶液。在最后一次洗滌完后，將反應(yīng)板在吸水紙上拍干。

第三步，加入檢測(cè)溶液。

在每個(gè)反應(yīng)孔中加入2滴檢測(cè)溶液。蓋好板蓋，在18～26℃條件下孵育30分鐘（可以有誤差2分鐘）。洗板。

第四步，加入酶標(biāo)抗體。

在每個(gè)反應(yīng)孔中加入2滴酶標(biāo)抗體。蓋好板蓋，在18～26℃條件下孵育30分鐘（可以有誤差2分鐘）。洗板。

第五步，加入底物液和終止液。

在每個(gè)反應(yīng)孔中加入2滴TMB底物溶液。在18～26℃條件下孵育15分鐘（可以有誤差1分鐘）。在每個(gè)反應(yīng)孔中加入2滴終止液終止反應(yīng)。在加終止液時(shí)要按加入底物溶液的順序進(jìn)行滴加。輕彈微量反應(yīng)板將反應(yīng)板中的溶液混勻。肉眼進(jìn)行讀板，對(duì)照孔呈藍(lán)色的為陽(yáng)性。

第六步，讀板及結(jié)果判定。

動(dòng)物的懷孕狀態(tài)是由肉眼觀察孔內(nèi)顏色決定的。如未觀察到藍(lán)色，顏色與陰性對(duì)照孔顏色相似，則此動(dòng)物被認(rèn)為是空懷。如觀察到藍(lán)色，則存在PAGs，此動(dòng)物被認(rèn)為是懷孕。如樣品孔顏色很難用肉眼分辨，則認(rèn)為可疑/疑似，推薦懷孕復(fù)檢。

2.應(yīng)用情況。

（1）為進(jìn)一步驗(yàn)證該試劑的準(zhǔn)確性，在一奶牛場(chǎng)采集奶牛血樣17頭份，其中包括直腸檢查已確定妊娠的奶牛，沒(méi)配種的空懷牛奶牛和配種后待檢奶牛。具體情況如表1。

經(jīng)檢測(cè)，其中2頭已懷孕奶牛檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，2頭未配種的奶牛檢測(cè)結(jié)果為陰性，說(shuō)明早期妊娠診斷試劑盒的準(zhǔn)確率為100%。

（2）應(yīng)用的效果分析。2014年5月21日對(duì)密云縣十里堡鎮(zhèn)久興奶牛場(chǎng)的24頭待檢奶牛進(jìn)行檢測(cè)。具體情況如表2。

共檢測(cè)24頭奶牛，其中28～35天采血用早期妊娠診斷試劑盒檢測(cè)出18頭為陽(yáng)性，6頭為陰性，60天直腸檢查18頭陽(yáng)性牛中有3頭為陰性，陰性的原因有可能為早期胚胎死亡。

三、小結(jié)

在現(xiàn)代規(guī)模化牧場(chǎng)管理中，提高奶牛終生產(chǎn)奶量，改變牧場(chǎng)繁殖效益是養(yǎng)殖戶追求的目標(biāo)。奶牛終身可以有更多的泌乳高峰，生產(chǎn)奶量的增加，較短的繁殖周期，可以提高繁殖性能和經(jīng)濟(jì)效益，這必須通過(guò)縮短配種期來(lái)實(shí)現(xiàn)，這些就需要盡早診斷出已配奶牛是否已經(jīng)懷孕。奶牛早期可視妊娠診技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確率高，增加奶產(chǎn)量，節(jié)約飼料成本等優(yōu)點(diǎn)，所以此項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用對(duì)于養(yǎng)牛業(yè)具有重要的意義。