沈陽市化工學校

前 言

冬蟲夏草與鹿茸、人參齊名為我國的傳統(tǒng)三大補品，是滋補強身的名貴中藥。隨著對蟲草認識的深入，國內(nèi)外市場對蟲草的需求日益擴大。但是，由于野生冬蟲夏草采收的不易，且對生長環(huán)境要求的嚴格性使得其資源稀少，價格昂貴。另外，因為需求的不斷增長，造成濫采濫挖，現(xiàn)在我國的野生蟲草資源大量減少，目前已被列為國家一級保護物種。

在冬蟲夏草供不應求的情況下，蛹蟲草日益受到人們的關注，為醫(yī)藥和保健開發(fā)了新的藥源和營養(yǎng)源。

蛹蟲草具有多種藥理作用:能增強巨噬細胞活性，抗炎、抗菌、抗癌、抗缺氧等;蛹蟲草能鎮(zhèn)靜催眠，提高機體免疫力，降血脂，防止動脈硬化，保護心、腦組織等。

目前國外對于蛹蟲草的研究比較少，主要研究比較多的集中在國內(nèi)。大多數(shù)廠家采用的是無菌接種、固體發(fā)酵開放式培養(yǎng)基、深加工提取活性物質等技術，產(chǎn)品的主要類型為蟲草子實體以及相應的生化提取多種成分的深加工產(chǎn)品兩種。但是鮮有對蟲草菌液以及液體菌種發(fā)酵的研究，在中職中藥專業(yè)及中草藥中職專業(yè)中開展實訓項目研究更是少之又少，本項目主要集中在蛹蟲草的人工育種菌液的研究、形成一套適合中職學校相關專業(yè)實訓教學的實訓方案。

1 材料與儀器

1.1 菌種

蛹夏草菌株

1.2 主要材料

大米粉、豆餅粉、麥芽粉、MgS04?7H2O、pH 試紙及調節(jié)試劑。

1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基（PDA）

1.4 主要儀器及設備

超凈工作臺、空調、菌種培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)箱、干燥箱、振蕩器、高壓蒸汽滅菌鍋、酸度計、奧林巴斯三目顯微鏡、解剖鏡、PDA 培養(yǎng)基。

2 實驗方法與步驟

2.1 組織分離育種

選無雜菌的罐頭瓶中長4～6cm 狀態(tài)好的蟲草：將子實體洗去土和雜物，用75%酒精消毒，用滅菌水沖洗后。在超凈工作臺上用手術刀將選用的子實體切成上下兩截，選取蟲草子實體，用接種針小心地截取子實體的中間偏向頂端部位或中間處，挑取所截取的子實體上面的一小塊內(nèi)部組織，接種到PDA 培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)從而獲得候選菌株，經(jīng)過栽培試驗，鑒別菌種的性能。

2.2.液體深層發(fā)酵培養(yǎng)

通過液體深層培養(yǎng)法獲得的蟲草菌絲體，菌絲體的化學成分接近從自然界中采集的蛹蟲草的化學成分，可從發(fā)酵液中得到所需物質，還能很大程度上縮短生產(chǎn)的周期。

2.3 出草試驗

于罐頭瓶中裝入大米，一定量的自來水，瓶口用雙層聚丙烯膜進行包扎。將罐頭瓶放在121℃滅菌1h。冷卻后，在無菌條件下進行注射接入液體菌。培養(yǎng)約7d，至培養(yǎng)基中長滿菌絲后上架。接種約50d，蟲草子實體頂部子囊殼開始膨大后采收。

2.4 菌種的保存

保藏菌株，測定菌絲干重和子實體產(chǎn)量。

3 結果

3.1 組織分離育種部位的選擇

選取蟲草有龜狀紋的部位，沿縱向切開一個小口，縱向撕開成兩塊，用接種針截取子實體中間偏向頂端部位或中間處，挑取所截取的子實體上面的一小塊內(nèi)部組織，接種到PDA 培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)從而獲得候選菌株，經(jīng)過栽培試驗，菌種的性能優(yōu)異。

表1 不同組織部位對蛹蟲草生長的影響

3.2 出草試驗溫度的控制

500 ml 罐頭瓶，裝大米25g，無菌處理過的注射器注入自來水40ml，自來水中含不同組分營養(yǎng)，瓶口采用雙層聚丙烯膜進行包扎。121℃滅菌1h。完全冷卻后，無菌條件下注射接入6ml 液體菌種，每個處理20 個重復。14℃～17℃、17℃～20℃、20℃～23℃、23℃～26℃溫度段條件下通風培養(yǎng)7d。期間照射（300lx 散射光），子實體突起出現(xiàn)后，光照強度加強，400lx 光間歇照射，1h 照射，80min 間歇，同時將罐頭瓶封口膜刺破，以增加通風。20℃～23℃通風條件下，暗條件培養(yǎng)，培養(yǎng)基中長滿菌絲后上架。接種約50d，蟲草子實體頂部子囊殼開始膨大后采收子實體產(chǎn)量最佳。

表2 不同溫度對蛹蟲草生長的影響

3.3 液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基

蟲草在進行菌絲發(fā)酵時碳源以蛋白胨為最優(yōu)，采用1：2 或1：3 的碳氮比較為合適；蛹蟲草菌絲發(fā)酵最佳培養(yǎng)基組成為5%大米粉、1．5%豆餅粉、1．5%麥芽粉、0．1%KH2P04，0．05%MgS04?7H2O。

表3 不同碳氮比對冬蟲夏草生長的影響

3.4 菌種的保存條件

10℃/5℃（晝夜）、黑暗、散射光、白熾燈持續(xù)照射三種實驗條件，保藏30d，散射光菌株表現(xiàn)為菌落邊緣整齊，菌絲致密，菌絲長速均勻穩(wěn)定，菌絲干重和子實體產(chǎn)量較高。

表4 不同光照對蛹蟲草生長的影響