郭 燕，張東銘，劉愛萍，付艷芹，張?zhí)K河

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科鄭州450014

#通訊作者，女，1956年2月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向:妊娠期糖尿病胰島素抵抗的相關(guān)因素，E-mail:zhangsuhe@126.com

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是糖尿病的一種特殊類型，對妊娠、分娩、產(chǎn)婦遠(yuǎn)期預(yù)后及圍產(chǎn)兒危害極大?，F(xiàn)多認(rèn)為胰島素抵抗(insulin resistance，IR)在GDM 的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用［1］。Tribbles 同源蛋白3(tribbles homolog protein 3，TRB3)是近年發(fā)現(xiàn)的一種具有廣泛生物學(xué)功能的基因，其作為Akt 信號通路的調(diào)節(jié)蛋白，可以和Akt/PKB 結(jié)合，抑制胰島素信號通路，參與IR 的發(fā)生，在IR 中發(fā)揮了重要作用［2］。作者建立一種妊娠期IR 動物模型，檢測模型動物TRB3 和Akt mRNA 的表達(dá)情況，研究妊娠期IR 的發(fā)生機(jī)制，為臨床有效預(yù)防和控制GDM 提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物選取與分組 雌性和雄性健康42日齡SD 大鼠(體重約200 g)及普通飼料(標(biāo)準(zhǔn)齒類)、高脂高糖飼料［3］均購自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。采用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后雌鼠隨機(jī)分為5組(每組15 只):普通飲食非妊娠組、普通飲食妊娠組、高脂高糖非妊娠組、高脂高糖妊娠組及高脂高糖妊娠后飲食干預(yù)組(干預(yù)組，妊娠前給予高脂高糖飼料，妊娠后給予普通飲食干預(yù))。各妊娠組雌鼠與雄鼠以2∶1比例合籠，次晨鏡檢雌鼠陰道，以鏡下可見精子為標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)記為第1 天，并隔離妊娠大鼠。雄性大鼠均用普通飼料飼養(yǎng)。

1.2 大鼠空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)及胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)檢測 妊娠組大鼠孕20 d 時，大鼠嚴(yán)格禁食12 h 以上，麻醉后心內(nèi)取血，4℃、3 000 r/min 離心10 min 分離血清，－20℃保存待測。用全自動生化檢測儀檢測FBG，ELISA 試劑盒測定FINS，由此計算HOMA-IR。

1.3 大鼠肝組織TRB3 和Akt mRNA 表達(dá)水平測定 大鼠取血后迅速采用頸椎脫臼法處死，取新鮮肝臟組織置液氮中迅速凍存24 h 后－80℃保存。采用RT-PCR 法檢測TRB3 和Akt mRNA 的表達(dá)。TRB3 上游引物序列5'-CGACAGATGGCTAGTGCG-3'，下游引物序列5'-AAGAGCAGGGCTGGTTCA-3'，擴(kuò)增片段大小為320 bp。Akt 上游引物序列5'-TT TATTGGCTACAAGGAACG-3'，下游引物序列5'-AGTCTGAATGGCGGTGGT-3'，擴(kuò)增片段大小為213 bp。GAPDH 上游引物序列 5'-CACGGCAAGT TCAACGGCACA-3'，下游引物序列5'-GCGGCATGT CAGATCCACAACG-3'，擴(kuò)增片段大小為588 bp。取約100 mg 肝組織加液氮研磨成細(xì)顆粒狀后加入Trizol 1 mL，參照說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以2 μL cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s，退火30 s(TRB3 及Akt 退火溫度為56℃，GAPDH 為58℃)，72℃延伸2 min，共35 個循環(huán);72℃總延伸6 min。取5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，EB 染色，在紫外線透射儀下觀察電泳條帶，用D-140 圖像記錄分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，以目的基因與內(nèi)參GAPDH 條帶灰度值之比作為目的基因的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0 處理數(shù)據(jù)。應(yīng)用2×2 析因設(shè)計的方差分析比較普通飲食非妊娠組、普通飲食妊娠組、高脂高糖非妊娠組、高脂高糖妊娠組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR 及肝組織中TRB3和Akt mRNA 表達(dá)水平的差異，應(yīng)用單因素方差分析比較干預(yù)組、普通飲食妊娠組、高脂高糖妊娠組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR 及肝組織中TRB3 mRNA和Akt mRNA 表達(dá)水平的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠FBG、FINS 和HOMA-IR 的比較見表1、2。由表1可知，妊娠、高脂高糖飲食均可致大鼠HOMA-IR 升高，且二因素有交互作用。由表2可知，干預(yù)組HOMA-IR 較高脂高糖妊娠組降低，但仍高于普通飲食妊娠組。

表1 4組大鼠FBG、FINS 和HOMA-IR 的比較

表2 3組大鼠FBG、FINS 和HOMA-IR 的比較

2.2 各組大鼠肝組織中TRB3、Akt mRNA 表達(dá)水平的比較 見圖1和表3、4。由表3可知，妊娠、高脂高糖飲食均可致大鼠肝組織中TRB3 mRNA 的表達(dá)水平升高，Akt mRNA 的表達(dá)水平降低，且二因素有交互作用。由表4可知，干預(yù)組TRB3 mRNA 的表達(dá)水平較高脂高糖妊娠組降低，但仍高于普通飲食妊娠組;Akt mRNA 的表達(dá)水平較高脂高糖妊娠組升高，但仍低于普通飲食妊娠組。

圖1 大鼠肝組織中TRB3 和Akt mRNA 表達(dá)水平的比較

表3 4組大鼠TRB3 和Akt mRNA 表達(dá)水平的比較

表4 3組大鼠TRB3 和Akt mRNA 表達(dá)水平的比較

3 討論

GDM 具有復(fù)雜合并癥及高發(fā)病率的特點(diǎn)，已引起廣泛關(guān)注，而IR 作為GDM 的主要病理生理特征，在GDM 的發(fā)病機(jī)制研究中處于核心地位。研究胰島素敏感性有多種方法，正常血糖胰島素鉗夾技術(shù)是其中的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但這種方法操作復(fù)雜，費(fèi)用高，限制了其在臨床上的應(yīng)用。目前穩(wěn)態(tài)模型評估法在臨床實(shí)踐中應(yīng)用廣泛，只需簡單測定FBG 和FINS值，即可評估人體胰島素敏感性和分泌功能［4］。作者根據(jù)我國高碳水化合物飲食的特點(diǎn)，建立類似臨床妊娠期IR 的大鼠模型，通過FBG、FINS 和HOMA-IR 等指標(biāo)來評價成模情況［5］。該研究結(jié)果顯示妊娠末期高脂高糖組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR 指標(biāo)均明顯升高，提示造模成功。

TRB3 屬于Tribbles 家族。Tribbles 家族都無ATP 結(jié)合位點(diǎn)，而且激酶區(qū)域亦缺少正常的催化核心序列;雖然缺乏激酶活性，但TRB3 在不同的細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮著多種多樣的正負(fù)調(diào)控作用［6］。對哺乳動物的研究［7］顯示，TRB3 表達(dá)水平存在差異，在人和鼠的肝臟中表達(dá)最高。既往學(xué)者［8］發(fā)現(xiàn)，Akt/PKB 分子在胰島素信號傳導(dǎo)通路上發(fā)揮重要作用，它的磷酸化水平改變可直接影響IR的發(fā)生。Du 等［9］證實(shí)TRB3 可以通過抑制Akt Threonine308 和Serine473 位點(diǎn)的磷酸化水平，干擾胰島素信號傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致IR 的發(fā)生;敲除TRB3基因則可提升Akt 活性，增強(qiáng)肝細(xì)胞對胰島素的敏感性，降低IR。He 等［10］的研究則發(fā)現(xiàn)TRB3 還可以通過干擾Akt 的轉(zhuǎn)膜即與Akt 的PH 區(qū)域結(jié)合，干擾其和細(xì)胞膜上相應(yīng)信號位點(diǎn)的結(jié)合，從而阻斷胰島素信號通路的傳導(dǎo)。GDM 狀態(tài)下IR 更為明顯，有關(guān)GDM 狀態(tài)下TRB3 表達(dá)增高抑制PI3K/Akt 活化從而影響胰島素信號傳導(dǎo)通路的研究卻尚少，有待于進(jìn)一步探討。

作者的研究結(jié)果提示，高脂高糖妊娠組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR 指標(biāo)均較普通飲食妊娠組明顯升高，提示在高脂高糖飲食妊娠狀態(tài)下IR 更明顯;此外，高脂高糖妊娠組大鼠TRB3 mRNA 的表達(dá)水平明顯高于高脂高糖非妊娠組和普通飲食妊娠組，而Akt mRNA 的表達(dá)水平明顯減低，表明TRB3/Akt 信號通路在飲食及妊娠條件影響下促進(jìn)了妊娠期糖代謝紊亂和IR 的發(fā)生發(fā)展。研究結(jié)果還顯示，與高脂高糖妊娠組相比，干預(yù)組HOMA-IR、TRB3 mRNA 表達(dá)水平降低，Akt mRNA 表達(dá)水平升高，提示單純飲食干預(yù)對于改善GDM TRB3/Akt 信號通路從而減輕IR 有重要作用。

人類妊娠期間用藥有其特殊性，因此飲食干預(yù)對于GDM 患者的影響較為重要。另外，人類妊娠期更長，臨床上長期飲食干預(yù)對GDM 患者肝臟組織中TRB3/Akt 信號通路及基因表達(dá)的影響有待于進(jìn)一步研究，以期為飲食干預(yù)用于臨床預(yù)防及治療GDM 提供新的理論依據(jù)。

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