王偉瓊，王 沖，劉延方，郝倩倩，馬 杰

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科 鄭州450052

#通訊作者，男，1962年5月生，教授，主任醫(yī)師，研究方向:血液系統(tǒng)惡性腫瘤的基礎(chǔ)及臨床，E-mail:liuyanfang@zzu.edu.cn

端粒重復(fù)序列結(jié)合蛋白1(telomeric repeat binding factor 1，TRF1)是第一個(gè)被鑒定出來(lái)的端粒結(jié)合蛋白。TRF1 由439 個(gè)氨基酸組成，通過(guò)抑制端粒酶和端粒末端的接近程度負(fù)向調(diào)控端粒的長(zhǎng)度。在端粒酶陽(yáng)性細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)TRF1 將導(dǎo)致端粒長(zhǎng)度的縮短，而TRF1 的功能缺失突變體則會(huì)導(dǎo)致端粒長(zhǎng)度不正常的增加［1］。作者的前期研究［2］發(fā)現(xiàn):在有絲分裂期，TRF1 能夠定位于中心體且用siRNA 沉默TRF1 能夠?qū)е露鄻O紡錘體的出現(xiàn)，但TRF1 通過(guò)何種作用機(jī)制參與細(xì)胞周期的調(diào)控尚不清楚。該研究中，作者采用酵母雙雜交方法尋找與TRF1 相互作用的蛋白，為探討TRF1 在細(xì)胞有絲分裂期的調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 人宮頸癌HeLa 細(xì)胞株由鄭州大學(xué)血液病研究所保存。含有Flag 標(biāo)記的p3XFLAG-myc-TRF1 真核表達(dá)質(zhì)粒由洛克菲勒大學(xué)Tetia de Lange 教授惠贈(zèng)。胎牛血清購(gòu)自Hyclone 公司，青、鏈霉素，DMEM 培養(yǎng)基及蛋白A 和蛋白G 瓊脂凝膠珠購(gòu)自Invitrogen 公司，胰蛋白酶購(gòu)自華美(SABC)公司。鼠抗Myc 單克隆抗體、鼠抗GST 單克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling 公司，鼠抗TRF1 單克隆抗體購(gòu)自Abnova 公司，鼠抗SAM68 單克隆抗體購(gòu)自Abcam 公司，羅丹明偶聯(lián)羊抗鼠IgG 抗體購(gòu)自Jackson Immunoresearch 公司。AH109 酵母菌種以及pGBKT7、pEGST-C3 質(zhì)粒均由鄭州大學(xué)血液病研究所保存。人HeLa 細(xì)胞cDNA 文庫(kù)、MatchmakerTMGAL4 Two-Hybrid System 3 試劑盒購(gòu)自Clontech 公司，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、SalⅠ、T4 DNA 連接酶、pyrobest 酶及相關(guān)緩沖液購(gòu)自TaKaRa 公司，LipofectamineTM2000 購(gòu)自Invitrogen 公司。

1.2 TRF1 誘餌蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 以含有TRF1 全長(zhǎng)的p3XFLAG-myc-TRF1 真核表達(dá)質(zhì)粒為模板擴(kuò)增TRF1 基因序列全長(zhǎng)，測(cè)序后將TRF1全長(zhǎng)片段亞克隆到酵母表達(dá)載體pGBKT7，少量提取質(zhì)粒;EcoRⅠ和SalⅠ酶切鑒定并測(cè)序證實(shí)。同法獲得pGBKT7-TRF1 和pEGST-TRF1 重組質(zhì)粒。將pGBKT7(陽(yáng)性對(duì)照)和pGBKT7-TRF1 分別轉(zhuǎn)化AH109感受態(tài)酵母菌，接種于SDP/-Leu 培養(yǎng)板，30℃培養(yǎng)觀察，免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRF1 蛋白的表達(dá)。

1.3 酵母雙雜交［3］實(shí)驗(yàn) 以pGBKT7-TRF1 為誘餌質(zhì)粒篩選人HeLa 細(xì)胞cDNA 文庫(kù)，共篩選1×108個(gè)cDNA，經(jīng)β-半乳糖苷酶活性測(cè)定以及2 輪SD/-Trp/-Leu/X-α-gal 培 養(yǎng) 板 和2 輪SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/ X-α-gal 培養(yǎng)板篩選后，將陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR 反應(yīng)，將PCR 產(chǎn)物大小一致的質(zhì)粒行酶切以排除重復(fù)質(zhì)粒，進(jìn)一步經(jīng)核苷酸序列測(cè)定，并與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比較。

1.4 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn) 收集HeLa 細(xì)胞，加入RIPA緩沖液進(jìn)行裂解，取2%的細(xì)胞裂解液作為樣品對(duì)照，剩余部分均分為2 份，1 份加入正常小鼠血清及蛋白A 和蛋白G 瓊脂凝膠珠(空白對(duì)照)，1 份加入正常小鼠血清、蛋白A 和蛋白G 瓊脂凝膠珠及1 μg鼠抗TRF1 單克隆抗體(免疫共沉淀組)，搖床上4℃旋轉(zhuǎn)過(guò)夜孵育以捕獲目的蛋白。將蛋白裂解物及免疫共沉淀復(fù)合物用上樣緩沖液加熱變性，SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，以鼠抗TRF1 單克隆抗體和鼠抗SAM68 單克隆抗體檢測(cè)，再以相應(yīng)二抗孵育后，用ECL 發(fā)光底物壓片顯影。

1.5 體外沉降實(shí)驗(yàn) GST 融合蛋白及GST-TRF1融合蛋白的體外表達(dá)及純化參照Qiagen 公司重組GST 蛋白純化樹脂說(shuō)明書操作。體外沉降實(shí)驗(yàn)操作步驟參照文獻(xiàn)［3］進(jìn)行，共分為3組進(jìn)行檢測(cè):HeLa細(xì)胞裂解液經(jīng)RIPA 緩沖液預(yù)清除后，首先取20 μL裂解液作為內(nèi)參對(duì)照(內(nèi)參對(duì)照組)，再分別與GST對(duì)照蛋白(GST 對(duì)照蛋白組)和GST-TRF1 融合蛋白(GST-TRF1 融合蛋白組)共同孵育，隨后以SDSPAGE 電泳分離產(chǎn)物后，以抗GST 單克隆抗體及抗SAM68 單克隆抗體進(jìn)行免疫印跡分析。

2 結(jié)果

2.1 TRF1 誘餌蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建 pGBKT7-TRF1 雙酶切結(jié)果見圖1。pGBKT7-TRF1 轉(zhuǎn)化菌株生長(zhǎng)良好，與pGBKT7 轉(zhuǎn)化菌株生長(zhǎng)速度無(wú)明顯差異，表明TRF1 蛋白對(duì)AH109 酵母菌沒(méi)有毒性。免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)pGBKT7-TRF1 能在AH109 酵母菌中正確表達(dá)，見圖2。

2.2 酵母雙雜交篩選結(jié)果 經(jīng)酵母雙雜交最終篩選出5 個(gè)與人TRF1 相互作用的蛋白，分別是人SAM68 蛋白、Cullin1 蛋白、Polo-like kinase 1(Plk1)蛋白、Hsp70 以及activating transcription factor/cAMP responsive element binding protein(ATF5 蛋白)。

2.3 SAM68 與TRF1 的免疫共沉淀和體外沉降實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在HeLa 細(xì)胞株中，內(nèi)源性TRF1 能夠與SAM68 抗體發(fā)生共沉淀反應(yīng)，形成復(fù)合物，而與空白對(duì)照血清無(wú)結(jié)合(圖3)，表明TRF1 與SAM68 可能在細(xì)胞內(nèi)相互結(jié)合。GST-TRF1 能夠與SAM68 相結(jié)合，形成復(fù)合物，而GST 蛋白則不能將SAM68 沉淀下來(lái)(圖4)，提示TRF1 與SAM68 能夠在體外相互結(jié)合。

圖1 重組質(zhì)粒pGBKT7-TRF1 的鑒定

圖2 pGBKT7-TRF1 在酵母菌AH109 中的表達(dá)

圖3 SAM68 與TRF1 結(jié)合的免疫共沉淀結(jié)果

圖4 TRF1 與SAM68 的體外沉降實(shí)驗(yàn)

3 討論

酵母雙雜交系統(tǒng)是以酵母遺傳系統(tǒng)為基礎(chǔ)，研究反式作用因子之間的相互作用對(duì)真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控影響的一種技術(shù)。其最有價(jià)值的應(yīng)用是用BD-X篩選由AD-Y 構(gòu)成的cDNA 文庫(kù)，從而發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)之間的相互作用。該技術(shù)不僅可用于鑒定新的蛋白質(zhì)相互作用，證實(shí)可疑相互作用，確定相互作用的結(jié)構(gòu)域，而且可直接獲得編碼相互作用蛋白質(zhì)的基因。

端粒是存在于真核生物線性染色體末端由核酸DNA 重復(fù)序列和蛋白質(zhì)組成的特殊保護(hù)性結(jié)構(gòu)，對(duì)于維持染色體的完整性和基因組的穩(wěn)定性具有極其重要的生物學(xué)意義。端粒異常將導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定，而染色體的不穩(wěn)定性與細(xì)胞衰老及腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。端粒長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)的維持受端粒結(jié)合蛋白的調(diào)控。TRF1 是以端粒序列(TTAGGG)27 為探針，從HeLa 細(xì)胞核裂解產(chǎn)物中分離純化獲得的第一個(gè)人端粒雙鏈結(jié)合蛋白［1］，它以同源二聚體的形式直接與端粒雙鏈DNA 結(jié)合，通過(guò)調(diào)控端粒酶的活性以及端粒酶和端粒DNA 的接近程度，起到維持端粒長(zhǎng)度與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用［4-5］。已有研究［6］顯示，TRF1在包括急性白血病在內(nèi)的多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，而過(guò)量表達(dá)外源性TRF1 將促使細(xì)胞提前進(jìn)入有絲分裂期并發(fā)生凋亡。另有研究［7］表明，TRF1 能夠參與細(xì)胞有絲分裂期的調(diào)控，在中心體形成的調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但其具體作用機(jī)制及修飾途徑目前仍不清楚。

該研究中，作者采用酵母雙雜交系統(tǒng)，以pGBKT7-TRF1 為誘餌篩選人HeLa 細(xì)胞cDNA 文庫(kù)，成功篩選出一批TRF1 的新的結(jié)合蛋白，并首次發(fā)現(xiàn)SAM68 可以與TRF1 在體內(nèi)和體外相互作用。SAM68 是一個(gè)RNA 結(jié)合蛋白，在RNA 的剪切和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起調(diào)控作用［8］;此外，SAM68 在細(xì)胞有絲分裂調(diào)節(jié)以及腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中亦起到重要的調(diào)節(jié)作用［9］。該項(xiàng)研究首次表明端粒結(jié)合蛋白TRF1 能夠與RNA 結(jié)合蛋白SAM68 發(fā)生相互作用，這為進(jìn)一步研究端粒結(jié)合蛋白在細(xì)胞有絲分裂時(shí)相的調(diào)節(jié)及RNA 在調(diào)控和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的功能提供了新的研究線索，也為進(jìn)一步研究TRF1 對(duì)細(xì)胞周期和凋亡調(diào)控的影響提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

綜上所述，作者鑒定出了5 個(gè)新的與TRF1 相互作用的蛋白質(zhì);通過(guò)體內(nèi)及體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)了SAM68 是一個(gè)新的TRF1 結(jié)合蛋白。TRF1 有可能是一個(gè)新的連接端粒和細(xì)胞有絲分裂調(diào)控的通路蛋白，其可能通過(guò)與SAM68 的結(jié)合參與RNA 剪切及轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的調(diào)控;選擇TRF1 作為基因治療的靶點(diǎn)，可能為腫瘤的靶向治療提供新的線索。

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