李 靜，王 菲，劉艷芬，王麗萍，許鈺杰，王 盟，張 斌，張 毅

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物治療中心 鄭州450052 3)鄭州大學(xué)生物工程系鄭州450001 4)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科鄭州450052 5)美國西北大學(xué)醫(yī)學(xué)院芝加哥60611 6)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點學(xué)科開放實驗室鄭州450052

#通訊作者，男，1964年4月生，博士，教授，研究方向:腫瘤免疫學(xué)、腫瘤干細(xì)胞和生物細(xì)胞治療，E-mail:yizhang@zzu.edu.cn

初始狀態(tài)T 細(xì)胞和記憶性T 細(xì)胞在特異性免疫應(yīng)答時僅分泌少量的細(xì)胞因子，但在刺激物作用下，淋巴細(xì)胞發(fā)生活化，可以分泌大量的細(xì)胞因子［1］。佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)和離子霉素作為淋巴細(xì)胞激活劑被應(yīng)用于刺激淋巴細(xì)胞增殖及分泌細(xì)胞因子等多種實驗研究中［2］。在抗腫瘤的淋巴細(xì)胞治療中，在培養(yǎng)臨床應(yīng)用級別的淋巴細(xì)胞時，抗CD3 單抗和抗CD28 單抗作為刺激劑聯(lián)合應(yīng)用可有效增強淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性和增殖能力［3］，因此，在這些培養(yǎng)后的淋巴細(xì)胞臨床應(yīng)用前，可應(yīng)用抗CD3 單抗和抗CD28 單抗來判斷其功能和活性。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer cell，CIK 細(xì)胞)是一群異質(zhì)性免疫活性細(xì)胞，具有較強的抗腫瘤能力［4］。該研究比較了抗CD3單抗聯(lián)合不同濃度抗CD28 單抗對CIK 細(xì)胞IFN-γ、IL-10、TNF-α、IL-2 及穿孔素(perforin)分泌的影響，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 外周血標(biāo)本來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院確診為癌癥的6例患者，標(biāo)本均征得患者同意并簽訂知情同意書后采集。

1.2 主要試劑與儀器 PMA、離子霉素、布雷桿氏菌素A(BFA)、皂苷等均購自美國Sigma 公司，抗CD3 單抗和抗CD28 單抗購自美國BD PharMingen公司，重組人IL-2 購自北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司，重組人IFN-γ 購自上海凱茂藥業(yè)有限公司，淋巴細(xì)胞分離液購自上海華精生物高科技有限公司，Hyclone RPMI 1640 培養(yǎng)基購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司，胎牛血清購自Gibco 公司。各種免疫熒光抗體(FITC-perforin、PE-IFN-γ、PerCP-CD8、APC-CD4、PE-CY7-CD3)均購自德國美天旎公司。IL-10、IL-2、IFN-γ、TNF-α ELISA 檢測試劑盒購自美國Biolegend 公司。流式細(xì)胞儀購自美國BD 公司。

1.3 實驗分組 將6例患者的外周血混合，取10 mL，肝素鈉抗凝，1 500 r/min 離心10 min，按文獻(xiàn)［5］方法處理，用IFN-γ、CD3、IL-2 誘導(dǎo)培養(yǎng)，第13天CIK 細(xì)胞成熟。取部分CIK 細(xì)胞，PBS 洗滌后計數(shù)，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106mL－1，于24 孔板中分4組進(jìn)行培養(yǎng)，分別加入50 μg/L PMA 和750 μg/L 離子霉素(對照組)、1.0 mg/L 抗CD3 單抗和2.5 mg/L 抗CD28 單抗(A組)、1.0 mg/L 抗CD3單抗和1.0 mg/L 抗CD28 單抗(B組)、1.0 mg/L 抗CD3 單抗和0.5 mg/L 抗CD28 單抗(C組)，于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組6 個復(fù)孔。

1.4 觀測指標(biāo)

1.4.1 胞內(nèi)因子染色法檢測CIK 細(xì)胞中IFN-γ 和穿孔素的表達(dá)情況 培養(yǎng)3 h 后，各組細(xì)胞加入阻斷劑BFA 1 mg/L，充分混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后收獲細(xì)胞。加入相應(yīng)抗體(PE-CY7-CD3、PerCP-CD8、APC-CD4)室溫避光孵育15 min，多聚甲醛固定20 min，用破膜劑皂苷破膜后加入胞內(nèi)抗體(FITC-perforin、PE-IFN-γ)共孵育30 min，PBS 洗一次，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.4.2 ELISA 法檢測CIK 細(xì)胞IL-2、IFN-γ、IL-10和TNF-α 的分泌水平 培養(yǎng)24 h 后收獲各組細(xì)胞，離心后取上清，采用ELISA 法進(jìn)行IL-2、IFN-γ、IL-10、TNF-α 的檢測，按試劑盒說明書操作。采用CurveExpert 1.3 Elisa 軟件計算細(xì)胞因子濃度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0 進(jìn)行處理。4組細(xì)胞因子表達(dá)水平和分泌水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗，檢驗水準(zhǔn)α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組CIK 細(xì)胞中細(xì)胞因子表達(dá)情況的比較見表1。

表1 4組CIK 細(xì)胞中細(xì)胞因子表達(dá)水平的比較

2.2 4組CIK 細(xì)胞細(xì)胞因子分泌水平的比較 見表2。

表2 4組CIK 細(xì)胞細(xì)胞因子分泌水平的比較

3 討論

PMA 和離子霉素為非特異性刺激物，常常用于刺激淋巴細(xì)胞增殖或分泌功能的研究，然而這種共刺激僅能用于體外實驗，不能應(yīng)用于臨床。有研究［6］表明，低于75 μg/L 的PMA 和低于10 mg/L 的離子霉素共刺激不會引起淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)的改變，因此該研究中，作者采用50 μg/L 的PMA和750 μg/L 的離子霉素進(jìn)行共刺激作為對照。目前國內(nèi)外多將抗CD3/CD28 抗體聯(lián)合用于T 淋巴細(xì)胞的體外激活，并將殺傷性T 淋巴細(xì)胞回輸給患者殺傷腫瘤細(xì)胞［7-8］。在抗CD28 抗體的協(xié)同作用下，抗CD3 抗體的刺激活性明顯提高［8-9］，因此臨床上采用抗CD28 抗體協(xié)同抗CD3 抗體體外活化T 淋巴細(xì)胞［10-11］。該研究探討了1.0 mg/L 抗CD3 單抗聯(lián)合不同濃度抗CD28 單抗對CIK 細(xì)胞細(xì)胞因子分泌水平的影響。結(jié)果表明，不同濃度的抗CD28 單抗聯(lián)合抗CD3 單抗對CIK 細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響差異無臨床意義，考慮到費用，臨床上可選用1.0 mg/L 抗CD3 單抗聯(lián)合0.5 mg/L 抗CD28 單抗作為刺激物用于T 淋巴細(xì)胞的活化。

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