方雪，劉剛，邢苗，王紹文

1(深圳大學生命科學學院，深圳市微生物基因工程重點實驗室，廣東深圳，518060)

2(合肥師范學院生命科學系，安徽合肥，230601)

正在顯現(xiàn)的石油危機引起了各國對未來能源供應不足的普遍關(guān)注，并促使人類尋求可再生的燃料來代替化石燃料［1］。木質(zhì)纖維素是世界上最豐富而又未得到充分利用的可再生資源，以木質(zhì)纖維素為原料發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇和丁醇是解決燃油短缺的重要途徑［2］。

當前已有包括釀酒酵母、運動單孢發(fā)酵菌等多種微生物都能夠高效地發(fā)酵葡萄糖，但多存在五碳糖利用不足的問題。丙酮丁醇梭菌是一種嚴格厭氧的微生物，因它具有獨特的生理生化性質(zhì)，可以較快地利用木糖、阿拉伯糖等五碳糖獲得丙酮、丁醇、乙醇等產(chǎn)物［3］，特別適合于進行木質(zhì)纖維素的同步糖化發(fā)酵。為使丙酮丁醇發(fā)酵在工業(yè)生產(chǎn)中更具競爭力，首要考慮的方法是改良菌種，達到提高乙醇、丁醇產(chǎn)量的目的。

丙酮丁醇梭菌具有復雜的代謝途徑，能生成乙酸、丁酸、乙醇、丙酮與丁醇多種代謝產(chǎn)物［4］。隨著其基因組的測序完成，與上述酸和溶劑形成相關(guān)的基因在丙酮丁醇梭菌中被成功克?。?］。分子生物學和基因工程方法的應用為丙酮丁醇梭菌的代謝工程改造提供了有效工具。Sillers等［6］通過改變?nèi)?醇脫氫酶基因(adhE)的表達模式，利用ptb的強啟動子下調(diào)乙酸/丁酸轉(zhuǎn)移酶的表達，使adhE提前高度表達，結(jié)果乙醇和丁醇產(chǎn)量均有提高，突變株的溶劑總產(chǎn)量達到30 g/L，說明adhE基因?qū)Υ嫉倪x擇性較強。繼Mermelstein等［7］報道了丙酮丁醇梭菌電轉(zhuǎn)化方法后，Green和 Bennett［8］構(gòu)建非復制性質(zhì)粒使 adhE 失活，結(jié)果抑制丙酮生成，并使丁醇產(chǎn)量降低了85%，說明adhE基因在丁醇形成中起到重要作用。Tummala［9］利用反義RNA技術(shù)下調(diào)了丙酮途徑中的adc和ctfA/B的表達。使得丙酮和丁醇的產(chǎn)量明顯下降。說明ctfA/B在丙酮途徑中是關(guān)鍵基因，并有研究發(fā)現(xiàn)ctfA和ctfB基因與adhE一起位于sol操縱子［10-11］中。

本實驗在研究丙酮丁醇梭菌發(fā)酵特性的基礎(chǔ)上采用基因工程技術(shù)對其進行代謝工程改造，通過增強醛/醇脫氫酶基因(adhE)表達的方法獲得了發(fā)酵產(chǎn)物組成出現(xiàn)變化，溶劑產(chǎn)量一定程度提高的重組丙酮丁醇梭菌菌株，為獲得具有更優(yōu)良發(fā)酵性能的木質(zhì)纖維素同步糖化發(fā)酵菌株打下了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

實驗所用菌株及質(zhì)粒見表1。

1.2 丙酮丁醇梭菌的生理生化分析

從RCM平板挑取丙酮丁醇梭菌單菌落于CGM中37℃厭氧培養(yǎng)［13］，以10%(v/v)的接種量分別轉(zhuǎn)接于含2%(w/v)葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和纖維二糖的200 mL CGM液體培養(yǎng)基中。定期取樣，測定菌的生長情況和底物利用情況。生長情況用比濁法測出菌液在600 nm下的OD值，底物利用情況用3，5-二 硝基水楊酸(DNS)法［14］測定發(fā)酵液中還原糖濃度。

表1 菌種與質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

發(fā)酵結(jié)束后利用氣相色譜法分析發(fā)酵產(chǎn)物的組分濃度，計算發(fā)酵產(chǎn)物的得率，其得率定義為每利用1 g葡萄糖生成的發(fā)酵產(chǎn)物的量［15］。色譜型號為:Trace GC，Thermo;色譜柱為:Agilent DB-624毛細管柱(30 m×0.32 mm);檢測器為Flame Ionization Detector(FID)檢測器;初始溫度45℃，2 min;10℃/min升溫;最終溫度200℃，2 min。進樣口溫度為220℃;FID溫度為220℃;載氣N2流速為30 mL/min，氫氣流速為35 mL/min，空氣流速為350 mL/min。分別配制體積分數(shù)為 0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%的乙醇、乙酸、丙酮、丁酸和丁醇水溶液，通過色譜峰確定各內(nèi)標溶液的洗脫時間，并作出峰面積與溶液濃度的標準曲線，線性回歸得到線性方程和相關(guān)系數(shù)［16］。定期取樣，取1 μL上清液通過氣相色譜檢測后得到相應的峰面積，根據(jù)標準曲線計算出發(fā)酵液中乙酸、丁酸、乙醇、丙酮和丁醇的濃度。

1.3 整合型質(zhì)粒的構(gòu)建

1.3.1 目的基因的獲得

以丙酮丁醇梭菌基因組DNA為模板，PCR擴增與代謝途徑相關(guān)的酶基因thl的啟動子和末端序列及adhE的開放閱讀框和夏因-達爾加諾(SD)序列。其中thl編碼乙酰乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶，為擬敲除基因，thl的啟動子和末端序列作為同源重組時的同源序列，adhE編碼醛/醇脫氫酶基因，為擬增強基因。本研究所用寡核苷酸引物列入表2。

表2 用于PCR擴增的引物序列Tab.2 Oligonucleotides used for PCR

1.3.2 整合型質(zhì)粒pTAEE的構(gòu)建

質(zhì)粒pUC18和thl啟動子的PCR產(chǎn)物用HindⅢ和PstⅠ酶切，產(chǎn)物純化并連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coli ER2275，構(gòu)建成pTHLP。用BamHⅠ和KpnⅠ分別酶切質(zhì)粒pTHLP和thl末端序列的PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物純化并連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coli ER2275，構(gòu)建成pTE。將質(zhì)粒pTE和PCR擴增得到的erm抗性基因用XbaⅠ和BglⅡ酶切，產(chǎn)物純化并連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coli ER2275，構(gòu)建成pTEE。最后將質(zhì)粒pTEE和adhE的開放閱讀框及其上游SD序列的PCR產(chǎn)物用PstⅠ和XbaⅠ酶切，按上述方法構(gòu)建成整合型質(zhì)粒pTAEE。質(zhì)粒構(gòu)建圖譜見圖1。

圖1 整合型質(zhì)粒pTAEEFig.1 Construction of integrational plasmid pTAEE

1.4 整合型質(zhì)粒pTAEE的甲基化修飾

將整合型質(zhì)粒pTAEE轉(zhuǎn)化攜帶有質(zhì)粒pAN1(含有甲基化酶基因)的E.coli ER2275，37℃過夜培養(yǎng)。提取質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Fnu4HⅠ進行酶切鑒定。

1.5 丙酮丁醇梭菌的電轉(zhuǎn)化

將丙酮丁醇梭菌接種于CGM培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)。當OD600達到0.6時按10%接種量接種于60 mL含有0.4%Glycine的 RCM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600值為1.2。收集細胞后用冰浴的0.3 mol/L蔗糖［17］重懸菌體，冰上放置5 min。取0.6 mL處理好的菌液與15 μg重組質(zhì)?；靹蚝螅瑢⒒旌弦悍湃氡A冷的0.4 cm的電轉(zhuǎn)杯中，冰上放置2 min。用Bio-Rad 電擊儀作電轉(zhuǎn)化。電擊條件:200 Ω，25 μF，電擊電壓2.5 kF，電擊時間為5 ms，連續(xù)電擊3次后立即轉(zhuǎn)到10 mL預熱的RCM培養(yǎng)基中37℃溫育4 h。將上述菌液涂布于RCM平板上(pH 5.8，40 μg/mL紅霉素)。

1.6 丙酮丁醇梭菌的篩選與鑒定

篩選鑒定時，由于整合質(zhì)粒與丙酮丁醇梭菌發(fā)生同源重組，整合質(zhì)粒上的紅霉素抗性基因整合到重組菌的基因組上，所以重組菌具有紅霉素抗性。挑取RCM平板(40 μg/mL紅霉素)上的丙酮丁醇梭菌重組菌落在RCM平板上繼續(xù)傳代，轉(zhuǎn)接到CGM培養(yǎng)基中于厭氧環(huán)境37℃過夜培養(yǎng)。提取重組菌株的基因組DNA，進行PCR鑒定。

1.7 重組菌生理生化性質(zhì)的測定

取野生菌和重組菌同時按10%接種量進行培養(yǎng)，定期取樣，測定其生長情況、對底物的利用情況和發(fā)酵產(chǎn)物各組分的濃度，測定方法同1.2。

2 結(jié)果與討論

2.1 丙酮丁醇梭菌的生理生化分析

分別以葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和纖維二糖為唯一碳源，于厭氧培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)丙酮丁醇梭菌，其底物利用情況如圖2所示。通過比較發(fā)現(xiàn)該菌優(yōu)先利用葡萄糖，在發(fā)酵122 h后葡萄糖已被完全利用。取樣結(jié)束(180 h)后纖維二糖、木糖和阿拉伯糖的利用率分別為90.9%、64.9%、58.2%。因此，將丙酮丁醇梭菌用于木質(zhì)纖維素的同步糖化發(fā)酵具有以下2點優(yōu)勢:(1)可以解除纖維素酶水解產(chǎn)物抑制;(2)可以提高五碳糖的利用效率。

圖2 丙酮丁醇梭菌對不同碳源的利用情況Fig.2 Utilization of different carbon sources by C.acetobutylicum

以葡萄糖為唯一碳源培養(yǎng)丙酮丁醇梭菌，通過氣相色譜分析產(chǎn)物組分為:乙酸、丁酸、乙醇、丁醇、丙酮。由圖3可見，細胞在對數(shù)生長期主要合成有機酸(乙酸和丁酸);進入穩(wěn)定期后開始合成溶劑(丁醇、乙醇和丙酮)，發(fā)酵結(jié)束后溶劑的濃度約為4.33 g/L，丁醇的濃度約為2.82 g/L。結(jié)合同期底物消耗，計算得出丙酮丁醇梭菌發(fā)酵結(jié)束后溶劑得率為39%，丁醇得率為26%。

2.2 整合型質(zhì)粒pTAEE的構(gòu)建與驗證

以丙酮丁醇梭菌基因組DNA為模板，PCR擴增與代謝途徑相關(guān)的酶基因thl的啟動子，對thl啟動子的PCR產(chǎn)物進行HindⅢ、PstⅠ雙酶切，純化后與同樣處理的pUC18連接，構(gòu)建為pTHLP;對thl末端序列的PCR產(chǎn)物進行BamHⅠ、KpnⅠ雙酶切，純化后與同樣處理的pTHLP連接，構(gòu)建為pTE;以pIMP1為模板PCR擴增erm抗性基因，對erm抗性基因進行XbaⅠ、BglⅡ雙酶切，純化后連接到pTE上，構(gòu)建為pTEE，重組質(zhì)粒pTEE轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER2275后使得該菌株能在紅霉素抗性板上正常生長，說明紅霉素抗性基因得到表達;將adhE的開放閱讀框及上游SD序列連接到質(zhì)粒pTEE上，得到整合型質(zhì)粒pTAEE。用XbaⅠ和PstⅠ雙酶切，得到大小為2.7 kb和5 kb的片斷，以引物ADHE5和ADHE3進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物約為2.7 kb，測序證實插入基因片段的正確性。

圖3 C.acetobutylicum ATCC 824利用葡萄糖為碳源的發(fā)酵產(chǎn)物Fig.3 Production of solvents and acids of C.acetobutylicum ATCC 824 in glucose

提取整合型質(zhì)粒pTAEE，以其為模板，用相應引物進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠分析，結(jié)果如圖4所示:thl的啟動子、thl的末端序列，adhE的開放閱讀框及其上游SD序列的DNA片斷大小分別約為525 bp、537 bp和2 632 bp，與預期值相符，測序證明其序列正確。

圖4 整合型質(zhì)粒pTAEE的PCR驗證Fig.4 Identification of integrational plasmid pTAEE by PCR

2.3 整合型質(zhì)粒pTAEE的甲基化鑒定

提取被甲基化修飾的整合型質(zhì)粒 pTAEE，經(jīng)Fnu4HⅠ(Fnu4HⅠ為丙酮丁醇梭菌限制性內(nèi)切酶Cac824Ⅰ的同裂酶)酶切驗證已被甲基化，命名為pTAEE-pAN1。如圖5所示，未被甲基化的質(zhì)粒被Fnu4HⅠ切成若干小片斷，被甲基化的質(zhì)粒能防止Fnu4HⅠ的切割，也可以防止丙酮丁醇梭菌限制性內(nèi)切酶Cac824Ⅰ的切割。

圖5 pTAEE甲基化的酶切驗證Fig.5 Identification of methylation of the integrational plasmid pTAEE

2.4 重組菌株的篩選與鑒定

將質(zhì)粒pTAEE-pAN1電轉(zhuǎn)化丙酮丁醇梭菌后，在紅霉素抗性RCM板上篩選，得到20個陽性克隆，轉(zhuǎn)化效率為1.3個/μg。

提取重組菌株的基因組DNA，分別以THLP5和ERM3;ERM5和THLEN3為引物，PCR擴增重組片段thlp-adhE-erm和 erm-thlend，獲得大小為 4.3 kb和1.5 kb的重組片段(圖6)，說明重組菌株的基因組中整合了整合型質(zhì)粒中的重組片段thlp-adhE-erm和erm-thlend。為鑒定thl基因的完整性，分別以野生型菌株和重組菌株的基因組DNA為模板，THLP5和THLEN3為引物擴增thl基因啟動子和末端同源序列間的片段。PCR產(chǎn)物分析如圖7所示。表明整合質(zhì)粒中的thlp-thlend重組片段已經(jīng)整合到重組菌株中，增加了擬增強基因adhE的拷貝數(shù)，但是thl基因編碼框沒有被破壞，該重組菌株命名為丙酮丁醇梭菌T4。

圖6 C.acetobutylicum ATCC 824的轉(zhuǎn)化子T4的PCR驗證Fig.6 Identification of the C.acetobutylicum transformant of T4by PCR

圖7 thl基因編碼框完整性的PCR驗證Fig.7 Identification of the integrity of the ORF of thl gene

2.5 重組菌生理生化性質(zhì)的測定

將野生菌和重組菌T4同時按10%接種量厭氧培養(yǎng)，定期取樣，其生長情況、發(fā)酵液內(nèi)殘?zhí)橇亢桶l(fā)酵產(chǎn)物含量如圖8所示。重組菌T4和野生菌的生長情況沒有明顯差異，均在接種后12 h進入穩(wěn)定期，進入穩(wěn)定期后，重組菌T4較野生菌的生長緩慢，與重組菌產(chǎn)酸量增加抑制了細胞生長有關(guān)。野生菌在接種后36 h時葡萄糖幾乎被完全利用，重組菌T4在發(fā)酵結(jié)束時，發(fā)酵液內(nèi)殘?zhí)橇繛?.4 g/L，對葡萄糖的利用率為83%。

圖8 野生型丙酮丁醇梭菌與重組菌的發(fā)酵情況Fig.8 Fermentations of wild type and recombination C.acetobutylicum

發(fā)酵結(jié)束時，重組菌T4和野生菌的丁醇濃度分別為6.9、4.9 g/L，丁醇得率分別為41.6%、24.5%，乙醇濃度相當，均為0.39 g/L，乙醇得率分別為2.3%、2.0%。重組菌與野生菌相比丁醇濃度提高了40.8%，溶劑總濃度提高21.6%。

3 結(jié)論

本研究在測定丙酮丁醇梭菌生理生化性質(zhì)的基礎(chǔ)上，通過基因工程的方法對丙酮丁醇梭菌的代謝途徑進行改造，構(gòu)建非復制型整合質(zhì)粒pTAEE，電轉(zhuǎn)化丙酮丁醇梭菌后根據(jù)Campbell模式［18］可能發(fā)生以下幾種重組方式:(1)以thl基因啟動子端和末端兩個片段與基因組同源片段發(fā)生雙交換重組，結(jié)果如圖9(Ⅰ)所示。以該方式重組后會破壞thl基因的編碼框，使其不能正常轉(zhuǎn)錄表達。(2)以thl基因啟動子端或末端單個片段與基因組同源片段發(fā)生單交換重組，結(jié)果如圖9(Ⅱ)和(Ⅲ)所示。以該方式重組后同源序列將增加一個拷貝，能增強 adhE的表達。(3)以adhE1的開放閱讀框及其上游SD序列與基因組同源片段發(fā)生單交換重組。重組菌T4的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果說明該重組菌發(fā)生了如圖9(Ⅱ)所示的重組方式，雖然不會破壞thl基因的編碼框，但增強醛/醇脫氫酶基因(adhE)的表達。醛/醇脫氫酶是催化合成乙醇、丁醇的關(guān)鍵酶。adhE表達產(chǎn)物活性的增強會提高乙醇和丁醇的產(chǎn)量。發(fā)酵后重組菌T4的乙醇的發(fā)酵產(chǎn)量為0.39 g/L，與野生菌基本相當;丁醇的發(fā)酵產(chǎn)量為6.9 g/L，比野生菌提高了41%，獲得了發(fā)酵性能更高的丙酮丁醇梭菌代謝工程菌株，為進一步獲得性能優(yōu)良的木質(zhì)纖維素發(fā)酵菌打下了基礎(chǔ)。

圖9 整合型質(zhì)粒pTAEE的同源重組方式Fig.9 Homologous recombination method of integrational plasmid pTAEE

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