饒劍，吳盼盼，徐德平

(江南大學食品學院，江蘇無錫，214122)

花粉(pollen)是植物雄蕊所產(chǎn)生雄性生殖細胞，它集中了整個植物的精華，含有豐富的營養(yǎng)成分和藥用成分，被譽為完全營養(yǎng)素、微型營養(yǎng)庫［1］，它富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、酚類、黃酮類、磷脂、多種維生素和微量元素［2-3］。油菜蜂花粉是蜜蜂在采集的油菜花粉上加入花蜜和唾液形成的團粒狀物，具有很好的抗氧化、降血脂、抗前列腺增生、提高免疫力和抗腫瘤等諸多生理活性［4-5］。因此研究油菜蜂花粉的抗氧化性對其開發(fā)利用具有重要意義。

目前對花粉的抗氧化性研究主要集中在酚類化合物中，包括黃酮類和酚酸類化合物。近來有研究表明，花粉中還有很多成分具有很好的抗氧化性，如鄧建軍［6］等發(fā)現(xiàn)20% ～40%濃度硫酸銨鹽析得到的油菜蜂花粉水溶性蛋白對DPPH和·OH自由基具有很強的清除能力;何偉［7］等研究表明，蜂花粉油脂表現(xiàn)出較強的抗氧化力。但這些研究均以抗氧化活性評價為目的，未明確花粉中抗氧化物質(zhì)基礎(chǔ)。在本文的研究中發(fā)現(xiàn)，油菜蜂花粉脂溶性成分具有很好的抗氧化性。本課題通過體內(nèi)和體外2種方法研究油菜蜂花粉中脂溶性成分的抗氧化性，同時對具有抗氧化活性的部分進行研究并通過核磁等手段確定其物質(zhì)結(jié)構(gòu)。

1 材料與儀器

1.1 材料和試劑

油菜蜂花粉:購于南京老山藥業(yè)有限公司;昆明小鼠60只，雌雄各半，6周齡，20～25 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司;D-半乳糖:美國Sigma公司;總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒，蛋白定量試劑盒，丙二醛(MDA)測試盒，單胺氧化酶(MAO)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;GF254硅膠板，山東煙臺芝罘化工廠;ODS填料，Nacalai Tosoh Inc;MCI填料，Mitsubishi Chemical Corporation;其他試劑均為分析純，由國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 儀器和設(shè)備

DFY-600搖擺式高速中藥粉碎機，溫嶺市林大機械有限公司;CQ-005型萃取罐，常州市特威電氣自動化系統(tǒng)有限公司;中壓輸液泵，天津科器高新技術(shù)公司;R-1002型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申順生物科技有限公司;TU-1900型雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司;MLS-3780高壓蒸汽滅菌器，日本 Sanyo公司;CR3i高速冷凍離心機，美國Thermo公司;核磁共振儀 Avance 500MHz，Bruker公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 油菜蜂花粉的提取

將油菜蜂花粉粉碎過80目篩，稱取15 kg加入100 L萃取罐中，以料液比1∶5(g∶mL)加入體積分數(shù)為90%乙醇溶液，回流提取3 h，過濾出清液，將濾渣再按上述方法重復提取2次，合并清液減壓濃縮至適宜體積為止。加入適量的水，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓濃縮至干，得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物以及萃余物，后冷藏備用。

1.3.2 各萃取物總抗氧化能力的測定

取以上四種萃取物配制10 mg/mL試樣，按照TAOC試劑盒說明進行操作，在520 nm處測吸光度。試驗重復3次，取平均值。本實驗以樣品管與對照管在520 nm處的吸光度的差值(ΔA520)的大小來反映其總抗氧化能力，差值越大，總抗氧化能力越強。

1.3.3 各萃取物對D-半乳糖誘導衰老模型小鼠的抗氧化作用

1.3.3.1 D-半乳糖誘導衰老小鼠模型建立

昆明小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機分成6組，每組10只，雌雄小鼠各5只。正常對照組和衰老模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水;實驗組分別灌胃4種萃取物200 mg/(kg·d)。灌胃同時衰老模型組和實驗組每日皮下注射D-半乳糖500 mg/(kg·d)，建立小鼠亞急性衰老模型，連續(xù)6周［8-10］。正常對照組每日皮下注射等體積生理鹽水。

1.3.3.2 樣本制備和生化指標測定

末次給藥24 h后，將動物斷頸處理，摘取腦、肝、脾，脾臟用濾紙吸干殘血，稱質(zhì)量，計算器臟指數(shù)。肝和腦分別低溫研磨制成10%的組織勻漿，3 500 r/min，4℃條件下離心10 min，取上清液，-20℃保存。采用比色法測定肝組織的MDA含量及腦組織的MAO活力，蛋白采用 Lowry等［11］的方法測定，按試劑盒說明書操作。

1.3.3.3 統(tǒng)計分析

1.3.4 抗氧化部分的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定

將抗氧化性部分過 MCI反相柱(6 cm×100 cm)，流速15 mL/min，用乙醇溶劑梯度洗脫，洗出液用錐形瓶收集，TLC法跟蹤檢測洗脫液，將Rf值和顯色反應(yīng)一致的洗脫液合并減壓濃縮得到不同的細分部分，將各細分部分分別反復上ODS-B(3 cm×100 cm)、ODS-A(3 cm×100 cm)等色譜柱分離，用乙醇溶劑梯度洗脫，自動收集器15 mL/管收集洗脫液，采用TLC薄層法檢測，從石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物中各得到3個化合物。以二甲基亞砜(DMSO)為溶劑，四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標物，經(jīng)1H NMR、13C NMR等手段鑒定其化學結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 油菜蜂花粉不同萃取物的總抗氧化力(TAOC)的測定

從油菜蜂花粉中得到的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、萃余物的總抗氧化力如圖1所示。由圖1可知，石油醚萃取物總抗氧化力活性最強，ΔA520值達0.36，乙酸乙酯萃取物活性其次，ΔA520值達達0.31，正丁醇萃取物、萃余物幾乎沒有總抗氧化力。表明油菜蜂花粉乙醇提取物中抗氧化活性物質(zhì)主要集中在石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物中。

圖1 油菜蜂花粉中不同萃取物總抗氧化能力Fig.1 Total antioxidant capacity of different extracts in Rape Bee Pollen

2.2 油菜蜂花粉不同萃取物對小鼠抗氧化力的影響

從油菜蜂花粉中得到的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、萃余物4個部分對肝組織MDA水平和腦組織MAO活力影響如表1所示。

表1 油菜蜂花粉各萃取物對D-半乳糖誘導衰老小鼠抗氧化力影響(±S，n=10)Table 1 The antioxidant activity effects of each extract from Rape Bee Pollen for D-galactose induced aging mice(±S，n=10)

表1 油菜蜂花粉各萃取物對D-半乳糖誘導衰老小鼠抗氧化力影響(±S，n=10)Table 1 The antioxidant activity effects of each extract from Rape Bee Pollen for D-galactose induced aging mice(±S，n=10)

注:“*”表示與衰老模型組比較，有顯著性差異(P＜0.05);“＊＊”表示與衰老模型組比較，有極顯著性差異(P＜0.01)。

組別 體重/g脾臟指數(shù)/(mg·g-1)肝臟MDA含量/［nmol·(mg 蛋白)-1］腦組織MAO活力/［U·(mg蛋白)-1］正常對照組 39.46±3.33*36.30±4.58 2.78±0.22 23.60±2.03 17.55±1.56 3.06±0.35 24.97±1.35 17.03±1.06衰老模型組 35.46±3.82 2.55±0.28 26.87±1.76 18.93±1.68石油醚組 40.99±3.32＊＊ 3.13±0.23* 11.85±1.83＊＊16.05±1.32*乙酸乙酯組 39.84±1.82* 3.09±0.17 19.20±1.65* 16.30±0.69*正丁醇組 37.07±2.64 2.59±0.36 23.72±1.87 17.90±1.47萃余物組

從表1可見，與正常對照組相比，衰老模型組動物體重明顯小于正常對照組，呈顯著性差異(P＜0.05)，說明衰老模型組動物生長受到抑制，實驗組中石油醚組、乙酸乙酯組與模型組相比有顯著性差異(P＜0.05)，表明這2個部分對D-半乳糖衰老模型小鼠的生長有促進作用。石油醚脾臟指數(shù)明顯高于衰老模型組，有顯著性差異(P＜0.05)，而對照組和其他實驗組的脾臟指數(shù)同樣高于模型組，但是差異不顯著(P＞0.05)。

在小鼠肝組織MDA含量方面，與衰老模型組比較，石油醚組肝組織MDA水平明顯降低，差異極顯著(P＜0.01)。乙酸乙酯組能顯著降低肝組織MDA水平(P＜0.05)。正丁醇組和萃余物組肝臟MDA水平與模型組相比都沒有顯著性差異(P＞0.05)，說明油菜蜂花粉乙醇提取物中的石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物能明顯降低D-半乳糖誘導衰老模型小鼠肝臟MDA水平，提高衰老小鼠的抗氧化力。

在抗小鼠腦組織MAO活力方面，石油醚組和乙酸乙酯組動物腦組織MAO活力與模型組相比明顯降低(P＜0.05)，這說明石油醚組和乙酸乙酯組對降低D-半乳糖誘導衰老模型小鼠腦組織MAO活力有明顯作用。正丁醇組和萃余物組與模型組相比MAO活力也有一定程度的降低，但是沒有顯著性(P＞0.05)。

實驗結(jié)果表明油菜蜂花粉的抗氧化性成分主要集中在石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物中。

2.3 油菜蜂花粉中抗氧化性成分結(jié)構(gòu)鑒定

石油醚萃取物經(jīng)MCI、ODS反相色譜柱反復洗脫分離得到3個主要化合物，其薄層色圖如圖2。

圖2 石油醚萃取物經(jīng)分離得到的三個主要化合物的薄層色譜圖Fig.2 TLC of three main compounds separated from petroleum ether extract

進一步分離純化得到單體化合物，經(jīng)1H NMR、13C NMR解析并參照相關(guān)文獻［12-15］得出，化合物1為α-亞麻酸，化合物2為α-亞麻酸甘油酯，化合物3為3＇-甲氧基-α-亞麻酸甘油酯?；衔?和3是α-亞麻酸衍生物。

從乙酸乙酯萃取物中分離得到3個主要化合物，其單體化合物的薄層色譜圖如圖3所示。

圖3 乙酸乙酯萃取物經(jīng)分離得到的三個主要化合物的薄層色譜圖Fig.3 TLC of three main compounds separated from ethyl acetate extract

化合物經(jīng)結(jié)構(gòu)解析分別為化合物4:山奈酚-3-O-β-D 吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷，化合物5:槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，化合物6:山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。均為黃酮類物質(zhì)［16］。

3 結(jié)論

本研究以油菜蜂花粉90%乙醇提取物依次經(jīng)石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物以及萃余物4個部分，經(jīng)總抗氧化力(T-AOC)、抗小鼠肝組織MDA水平和腦組織MAO活力的測定，得出抗氧化性成分主要集中在石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物中。

經(jīng)MCI、ODS等反相柱分離純化得出，石油醚萃取物主要含 α-亞麻酸，α-亞麻酸甘油酯，3＇-甲氧基-α-亞麻酸甘油酯;乙酸乙酯萃取物中主要含有山奈酚-3-O-β-D 吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷，槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等成分。

大量文獻報道油菜蜂花粉具有很好的抗氧化活性，但大多僅進行體外抗氧化活性評價，沒有明確抗氧化活性成分的具體結(jié)構(gòu)。本研究以體內(nèi)外實驗相結(jié)合的方法找出油菜蜂花粉中抗氧化性成分，明確其所起的抗氧化作用并通過核磁鑒定出化合物結(jié)構(gòu)。

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