張嬌嬌，許學(xué)勤

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫，214122)

山藥(Rhizoma dioscoreae)為薯蕷科薯蕷屬蔓生植物的塊莖，其營養(yǎng)成分及生物活性成分較多［1］，具有較高的食用和藥用價值。但新鮮山藥水分含量大，皮薄肉嫩，容易發(fā)生機(jī)械損傷，既不耐儲藏也不方便運(yùn)輸，限制了它的流通。多年來，人們圍繞山藥制粉進(jìn)行了大量的研究，已經(jīng)報道的山藥粉的制備方法主要有熱風(fēng)干燥［2-3］、冷凍干燥［4-5］等，但在制備過程中，往往涉及大量水溶性黏液質(zhì)的流失。山藥黏液質(zhì)中含有大量蛋白質(zhì)和多糖，具有較強(qiáng)的持水力［6］，研究發(fā)現(xiàn)其對血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶［7］、DPPH·、O2-·及OH·均有較強(qiáng)的抑制作用［8-9］，并有降血壓［10］等活性。

為了利用山藥黏液質(zhì)，金金［11］曾將打漿后的鮮山藥進(jìn)行離心分離，分別利用上清液黏液質(zhì)和沉淀物制粉。但由于黏液質(zhì)黏度大，無法先濃縮再干燥，只能采用高成本的直接噴霧干燥法制粉。因此，有必要探索適當(dāng)降低黏液質(zhì)黏度的方法，以便能在噴霧干燥前，對分離的山藥黏液質(zhì)進(jìn)行濃縮，降低干燥成本。顧林［12］、王常青［13］等人曾報道了山藥加工過程中的打漿時間、溫度及pH都會使?jié){體的黏度發(fā)生變化，并認(rèn)為該變化主要是由于黏液質(zhì)中的多糖、蛋白質(zhì)分子變化所致。Takao［14］等人對山藥黏液質(zhì)的酶解試驗(yàn)結(jié)果也表明，其中的蛋白質(zhì)及多糖是影響?zhàn)ひ嘿|(zhì)黏度的重要因素。

本研究采用多種水解酶對山藥黏液質(zhì)進(jìn)行酶解，以黏度為指標(biāo)從中篩選出效果較明顯的酶進(jìn)行復(fù)配酶解試驗(yàn)，以期最大程度降低黏液質(zhì)的黏度，從而使山藥黏液質(zhì)在干燥前能夠得到適當(dāng)濃縮，以降低成本。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山藥，購于超市。

纖維素酶、甘露聚糖酶、果膠酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶等購于銳陽生物科技有限公司。

AB104-N型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;4K15高速冷凍離心機(jī)，美國SIGMA Sartorius公司;LVDV-Ⅱ+P型旋轉(zhuǎn)黏度計，美國Brookfield公司;DS-1高速組織搗碎機(jī)，上海標(biāo)本模型廠制造;DKZ-450型電熱恒溫振蕩水槽，上海森信試驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 山藥黏液質(zhì)的制備

選擇新鮮、無病斑的普通山藥，洗凈、去皮、切片，然后將山藥片用高速組織搗碎機(jī)(速度12 000 r/min)處理30 s，成為山藥漿。在4℃、10 000 g離心20 min［11］，分離沉淀物和所需的黏液質(zhì)上清液。

1.2.2 酶解

按試驗(yàn)設(shè)計比例加酶混合均勻，于50℃振蕩水中反應(yīng)。酶解結(jié)束后將反應(yīng)液在冰水浴中冷卻15 min，終止酶解反應(yīng)。冷卻的酶解液在4℃、10 000 g離心15min，得到除酶的離心上清液。

1.2.3 溫度對黏液質(zhì)穩(wěn)定性的影響

分別將山藥黏液質(zhì)置于 40、50、60、70、80、90、100℃恒溫水槽中保溫30 min，急冷至4℃，在此溫度下，以10 000 g離心15 min，測定上清液的黏度、蛋白質(zhì)和多糖含量及抗氧化活性，與未經(jīng)熱處理的黏液質(zhì)進(jìn)行比較。

1.2.4 酶種類的選擇

分別用纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、糖化酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶，對打漿后離心得到的黏液質(zhì)進(jìn)行酶解，加酶量為黏液質(zhì)質(zhì)量的0.4%，在各酶適宜溫度條件下酶解反應(yīng)70 min，反應(yīng)結(jié)束后冷卻、離心，然后測定上清液的黏度，根據(jù)酶解液黏度的降低程度確定進(jìn)一步試驗(yàn)用酶的種類。

1.2.5 復(fù)合酶解的單因素試驗(yàn)

酶解溫度∶按纖維素酶:甘露聚糖酶=3∶1的復(fù)合酶，加酶量 0.4%，分別于30、40、50、60、70 ℃酶解 70 min。

復(fù)合酶配比:分別按纖維素酶∶甘露聚糖酶=4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4添加復(fù)合酶 0.4%，50℃酶解70 min。

加酶量:分別按 0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的加酶量，加入纖維素酶∶甘露聚糖酶=3∶1的復(fù)合酶，50 ℃反應(yīng) 70 min。

酶解時間:按纖維素酶∶甘露聚糖酶=3∶1的復(fù)合酶配比、酶解溫度50℃、加酶量0.4%，取不同的反應(yīng)時間 0、20、40、60、80、100、120 min。

1.2.6 復(fù)合酶解的正交試驗(yàn)

在復(fù)合酶解單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以黏液質(zhì)黏度為考察指標(biāo)，選擇復(fù)合酶配比、酶用量、反應(yīng)時間3個因素進(jìn)行3水平正交實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 測定方法

1.2.7.1 黏度

采用LVDV-Ⅱ+P型旋轉(zhuǎn)黏度計。選擇SC4-18號轉(zhuǎn)子測定，測溫25℃，轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速80 r/min。

1.2.7.2 總糖

采用苯酚-硫酸快速測定方法。吸取1 mL樣品液，依次加入1 mL 6%的苯酚，搖勻，迅速加入5 mL濃H2SO4，搖勻;空白以1 mL蒸餾水代替樣品液;室溫下放置20 min后，在490 nm處測定樣液的吸光值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出黏液質(zhì)中總糖含量。

1.2.7.3 蛋白質(zhì)的測定

紫外分光光度快速測定法［15］。

1.2.7.4 DPPH·除率的測定

參照江波等人的方法［16］。利用DPPH無水乙醇溶液在517 nm處有紫色團(tuán)的特征吸收峰，測定加入抗氧化劑后，在517 nm處吸光值的下降表示其對DPPH·的清除能力。

1.2.7.5 總還原力的測定

參照李利華［17］及江波等人［16］的研究方法。

1.2.7.6 清除超氧陰離子能力的測定

參照王震宙［18］等人的試驗(yàn)方法。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

利用Origin作圖像處理，文中數(shù)據(jù)均以3次測定數(shù)據(jù)的平均值以及標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度對黏液質(zhì)的影響

將山藥黏液質(zhì)置于不同溫度的恒溫水槽中保溫30 min，考察溫度對黏液質(zhì)黏度及蛋白質(zhì)、多糖含量的影響，結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 溫度對黏液質(zhì)黏度的影響Fig.1 Effect of temperature on viscosity of mucilage

圖2 溫度對黏液質(zhì)成分的影響Fig.2 Effect of temperature on contents of mucilage

由圖1、圖2可知，山藥黏液質(zhì)的黏度、蛋白質(zhì)和多糖含量均隨溫度的上升而下降，而多糖含量隨溫度以一種緩慢的趨勢下降，三者的含量在30～50℃的下降速度均較緩慢。這一現(xiàn)象可以解釋為，隨著溫度增加，聚合物分子熱運(yùn)動加劇，分子間締合的氫鍵發(fā)生斷裂，從而使黏度下降，而多糖和蛋白質(zhì)含量的降低，可能與黏液中懸浮的非水溶性(或熱變性形成的聚合物)部分沉淀有關(guān)。在50～100℃，由于蛋白質(zhì)發(fā)生熱變性，蛋白質(zhì)含量急劇下降，多糖含量也緩慢下降，多糖-蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)受到破壞，黏度下降速度加快。因此，山藥黏液質(zhì)的黏度與蛋白質(zhì)、多糖含量呈正相關(guān)的關(guān)系。

圖3顯示，在30～50℃，山藥黏液質(zhì)的還原力及對DPPH·、O2-·的清除率變化趨勢平緩，說明在此溫度范圍內(nèi)，黏液質(zhì)的性質(zhì)較穩(wěn)定，溫度對其活性影響較小;而在50～100℃過程中，其抗氧化活性下降速率加劇，與黏度、蛋白質(zhì)含量的變化趨勢相似，說明隨著溫度升高，黏液質(zhì)中多糖-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)受到破壞，活性也隨之降低。因此，從保持黏液質(zhì)活性角度來說，加工處理過程的溫度不宜高于50℃。

圖3 溫度對黏液質(zhì)抗氧化活性的影響Fig.3 Effect of temperature on antioxidant activity of mucilage

2.2 酶種類的選擇

根據(jù)山藥黏液質(zhì)固形物中蛋白質(zhì)占25.02%和總糖占 67.79% 這一特點(diǎn)，以及王常青［13］、Takao［14］等人的試驗(yàn)結(jié)論，選用多種以這2類物質(zhì)為底物的水解酶對黏液質(zhì)進(jìn)行酶解，其對黏液質(zhì)黏度的影響如圖4所示。

圖4 酶種類對山藥黏液質(zhì)黏度的影響Fig.4 Effect of kinds of enzymes on viscosity of yam mucilage

由圖4可知，所選酶中，以纖維素酶和甘露聚糖酶的酶解對黏液質(zhì)黏度影響最大。黏液質(zhì)經(jīng)纖維素酶、甘露聚糖酶酶解后，黏度由28.16 mPa·s分別下降到19.51、20.17 mPa·s。甘露聚糖酶酶解能使黏液質(zhì)黏度明顯下降，主要原因是這種酶作用的底物甘露聚糖是山藥黏液質(zhì)多糖中的主要成分;而纖維酶是一種多酶制，除能水解葡聚糖中β-1，4糖苷鍵的多酶制劑外，對黏液質(zhì)中的木聚糖、可溶性纖維素等也有降解作用，使多糖分子量降低，從而降低體系黏度。所以，選擇纖維素酶、甘露聚糖酶兩種酶進(jìn)行復(fù)配酶解試驗(yàn)，以進(jìn)一步降低黏液質(zhì)的黏度。

2.3 復(fù)合酶解的單因素試驗(yàn)

2.3.1 酶解溫度對黏液質(zhì)黏度的影響

固定加酶量0.4%，纖維素酶與甘露聚糖酶配比為3∶1，反應(yīng)時間70 min，考察酶解溫度對黏液質(zhì)黏度的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 反應(yīng)溫度對山藥黏液質(zhì)黏度的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on viscosity of yam mucilage

由圖5可見，在30～70℃黏液質(zhì)黏度呈持續(xù)下降趨勢，而沒有表現(xiàn)出一般溫度對酶反應(yīng)影響的最適溫度行為。原因是，在60℃以前，酶活力隨溫度(朝最適溫度方向)上升而增強(qiáng)，對黏液質(zhì)的降解程度也增大，從而使黏度也隨之逐漸下降;而溫度上升到60℃時，樣品中開始出現(xiàn)少量絮狀物，到達(dá)70℃時，則有大量白色絮狀沉淀，離心后樣品液澄清透明，黏度產(chǎn)生不可逆性下降［13］，黏液質(zhì)中蛋白質(zhì)變性絮凝。因此，結(jié)合溫度對黏液質(zhì)影響結(jié)果(圖2和圖3)的討論，選擇試驗(yàn)溫度為50℃。

2.3.2 復(fù)合酶配比對黏液質(zhì)黏度的影響

固定加酶量0.4%，反應(yīng)時間70 min，酶解溫度50℃，考察纖維素酶與甘露聚糖酶不同配比對黏液質(zhì)黏度的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 纖維素酶/甘露聚糖酶對山藥黏液質(zhì)黏度的影響Fig.6 Effect of Celluse/Mannase on viscosity of yam mucilage

由圖6可看出，酶解液黏度隨纖維素酶-甘露聚糖酶復(fù)合配比表現(xiàn)出一種先下降再升高的趨勢，纖維素酶-甘露聚糖酶配比為3∶1時，黏度下降最明顯，由26.81 mPa·s降至14.69 mPa·s。過此配比點(diǎn)后，隨著甘露聚糖酶在復(fù)合酶中比例的增加，黏度下降程度逐漸減少。出現(xiàn)這種趨勢的可能原因是，加入的甘露聚糖酶為專一性酶，僅對甘露聚糖β-1，4糖苷鍵作用，添加量易達(dá)到飽和狀態(tài);而纖維素酶可降解多種糖分結(jié)構(gòu)，其添加比例的減少，會影響對某些成分的降解，從而影響?zhàn)ざ认陆?。因此，?yōu)化試驗(yàn)時，纖維素酶-甘露聚糖酶復(fù)合酶配比條件可圍繞3∶1選擇。

2.3.3 加酶量對粘液質(zhì)黏度的影響

固定纖維素酶與甘露聚糖酶配比為3∶1，反應(yīng)70 min，酶解溫度50℃，以不同復(fù)合酶添加量進(jìn)行試驗(yàn)，得到的結(jié)果如圖7所示。

圖7 酶添加量對山藥粘液質(zhì)黏度的影響Fig.7 Effect of the amount of enzyme on viscosity of yam mucilage

由圖7可知，隨著加酶量的增加，山藥黏液質(zhì)黏度呈現(xiàn)前面下降較快，后面下降趨緩的模式。這種黏度下降快慢模式的變化，出現(xiàn)在0.4% ～0.6%。因此，將加酶量控制在一定范圍內(nèi)，可能提高酶解過程酶的效力。從經(jīng)濟(jì)效益和酶解效果角度考慮，選擇加酶量0.4%、0.5%、0.6%作為正交試驗(yàn)的3水平。

2.3.4 反應(yīng)時間對黏液質(zhì)黏度的影響

固定加酶量0.4%，纖維素酶與甘露聚糖酶配比為3∶1，酶解溫度50℃，考察酶解反應(yīng)時間對黏液質(zhì)黏度的影響，結(jié)果如圖8所示。

由圖8可知，酶解時間對山藥黏液質(zhì)的黏度影響也呈現(xiàn)非線性的下降模式，前期黏度下降較快，后期黏度下降速度趨緩，在80 min處出現(xiàn)轉(zhuǎn)折。這是因?yàn)閯傞_始酶解時，底物濃度高，酶催化底物反應(yīng)速度也快，但底物濃度隨著酶解的進(jìn)行而下降，從而使得酶反應(yīng)速度也下降。因此，正交試驗(yàn)的酶解時間可選擇80 min左右。

2.4 復(fù)合酶解的正交試驗(yàn)

表1為采用L9(34)正交表設(shè)計的實(shí)驗(yàn)因素水平表，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

圖8 反應(yīng)時間對山藥黏液質(zhì)黏度的影響Fig.8 Effect of hydrolysis time on viscosity of yam mucilage

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal array design

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of the L9(34)orthogonal array design

由表2可以看出，影響?zhàn)ざ鹊闹鞔我蛩貫锽＞C＞A。表3的方差分析也表明，酶添加量對黏度影響較為顯著。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，選擇的最優(yōu)因素水平為:A2B3C3，即復(fù)合酶配比為2∶1，酶添加量為0.6%，反應(yīng)時間90 min。按照1.2.4的方法，根據(jù)1.2.6實(shí)驗(yàn)得到的酶解優(yōu)化條件，對山藥黏液質(zhì)進(jìn)行酶解，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，山藥黏液質(zhì)黏度由酶解前的26.09 mPa·s，降至 9.18 mPa·s，降低了 64.81%，效果顯著。

從總的效果來看，酶解使山藥黏液質(zhì)黏度降低的效果明顯，有利于噴霧干燥前的預(yù)濃縮。

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analisis of orthogonal array design

3 結(jié)論

山藥黏液質(zhì)黏度及生物活性與溫度有較大關(guān)系，超過60℃，黏液質(zhì)黏度會因出現(xiàn)明顯渾濁沉淀物而下降，同時抗氧化活性也隨之大大下降。由纖維素酶和甘露聚糖酶以2∶1配成的復(fù)合酶，在酶添加量0.6%、反應(yīng)90 min、50℃的優(yōu)化條件下，對山藥黏液質(zhì)時行酶解，可使山藥黏液質(zhì)的黏度降低近65%。主要原因是所選的纖維素酶、甘露聚糖酶可作用于粘液質(zhì)中多糖的糖苷鍵，將鏈長而復(fù)雜的多糖降解，降低其分子量，從而降低黏度［19］。該方法具有促成實(shí)現(xiàn)黏液質(zhì)先預(yù)濃縮再噴霧干燥工藝的潛力。

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