馬麗達(dá)，陳義倫，孫文靜，魏然，吳茂玉，和法濤

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安，271018)

酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)，俗稱嗜酸耐熱菌［1］，易污染果汁產(chǎn)品，一般認(rèn)為該菌來源于土壤［2］，通過落果、爛果、果皮、已感染的加工車間設(shè)備等傳染到加工果汁中，并在加工過程中繁殖，以芽孢的形式耐受果汁加工過程中的巴氏殺菌，一旦遇到合適的萌發(fā)環(huán)境即大量繁殖代謝產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚和鹵酚，使得果汁口感風(fēng)味變差，濁度升高乃至在包裝物底部形成白色沉淀［3］。研究表明，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌是導(dǎo)致蘋果汁酸敗的主要菌種［4］。該菌在低污染時(shí)難以檢出，產(chǎn)品流通及腐敗時(shí)才會(huì)被發(fā)現(xiàn)［5］。

本研究以金帥腐爛果為材料，在分離嗜酸耐熱菌并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)、生理生化及16S rDNA區(qū)鑒定的基礎(chǔ)上，對(duì)其生長(zhǎng)特性進(jìn)行初步探索，以期為進(jìn)一步完善嗜酸耐熱菌的控制方法，提高蘋果汁加工安全性提供理論和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株

金帥蘋果:自然腐爛蘋果。

標(biāo)準(zhǔn)菌:CICC 10374(=DSM 3922=ATCC 49025)由中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)402 培養(yǎng)基:CaCl20.19 g，MgSO40.5 g，(NH4)2SO40.20 g，KH2PO43.0 g，酵母浸膏 2.0 g，葡萄糖 5.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 4.0。

(2)K氏培養(yǎng)基:酵母浸膏2.5 g，蛋白胨5 g，葡萄糖 1 g，吐溫80 1 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 4.0。

(3)LB培養(yǎng)基:酵母浸膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl10 g，瓊脂 15 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0。

(4)PDA斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 4.0。

1.1.3 儀器與設(shè)備

PB-10pH計(jì)，Sartorius公司;電子顯微鏡YSZ-H，日本尼康光學(xué)儀器有限公司;PCR儀，Biometra Tcradient;凝膠成像系統(tǒng)，Upland.CA.USA;電泳儀DYY-8C，北京市六一儀器廠;數(shù)顯恒溫水浴鍋 HH-I，國(guó)華電器有限公司

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的分離、純化與篩選

(1)菌種分離:挑取金帥蘋果的腐爛部分，勻漿;稱取10 g勻漿，加入90 mL無菌水進(jìn)行懸浮;45℃、180 r/min 下振蕩培養(yǎng) 30min，制成 10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6的稀釋液，分別吸取 100 μL 涂布于402培養(yǎng)基上，45℃倒置培養(yǎng)3～4 d。挑取402培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)類似于標(biāo)準(zhǔn)菌的疑似菌落，劃線接種于LB平板上，45℃培養(yǎng)48 h，保留不能在LB平板上生長(zhǎng)，但能在402培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株，從而篩選出只能在酸性條件下生長(zhǎng)的嗜酸菌株。將由此篩選出的嗜酸菌制成菌懸液;將此菌懸液在80℃條件下熱處理10 min［6］，取0.1 mL菌液涂布于402培養(yǎng)基上，45℃培養(yǎng)48 h，觀察是否有菌落出現(xiàn)，此時(shí)生長(zhǎng)的菌種即為嗜酸耐熱菌。

(2)菌種純化:將分離得到的嗜酸耐熱菌菌株在K氏培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線純化，45℃恒溫條件下培養(yǎng)。按此方法連續(xù)劃線，直至單個(gè)平板上為形態(tài)單一的菌落。挑取平板上的單菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，得到純菌株。

(3)菌種保藏:將純菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，4℃保藏備用。

1.2.2 菌種鑒定

(1)菌落形態(tài)及顯微形態(tài)觀察:將所得的菌種在K氏培養(yǎng)基上劃線，進(jìn)行菌落(形態(tài)，顏色，大小，邊緣整齊度，透明度，黏稠度等)和顯微鏡觀察。

(2)生理生化鑒定:根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［7-8］對(duì)得到的細(xì)菌進(jìn)行生理生化鑒定。主要指標(biāo)包括碳源利用、氧化酶試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)。

(3)分子生物學(xué)鑒定

a.DNA的提取。將菌種接種在K氏液體培養(yǎng)基中，45℃，180 r/min搖床培養(yǎng)14 h，然后用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的DNA。

b.PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增使用的上游引物為27F，下游引物為1492R。

27F:5＇-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3＇;

1492R:5＇-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3＇。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50 μL，其中10×buffer 5 μL;Mg2+3 μL;dNTP 4 μL;引物各 1 μL;Taq 酶 0.4 μL;模板2 μL;雙蒸水補(bǔ)足到 50 μL。PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，58℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃保溫10 min。4℃保藏。

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送華大測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在軟件DNAMAN上進(jìn)行拼接，拼接結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 生長(zhǎng)特性的研究

(1)生長(zhǎng)曲線的繪制:將各菌株的活化液分別接種在K氏液體培養(yǎng)基中，45℃、180 r/min搖床培養(yǎng)。并于接種后的第 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 和24 h，以未接種菌種的空白K氏液體培養(yǎng)基作為空白，取菌液于1 cm比色杯利用分光光度計(jì)測(cè)定600 nm處的吸光度，繪制出各菌株的生長(zhǎng)曲線。

(2)溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響:將各菌株接種在K氏液體培養(yǎng)基中在不同的溫度(20、25、30、35、40、45、50、55、60、65℃)條件下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，45℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)16 h后，以未接種菌種的空白K氏液體培養(yǎng)基作為空白，取菌液于1 cm比色杯利用分光光度計(jì)測(cè)定600 nm處的吸光度，得出菌株在不同溫度條件下的生長(zhǎng)情況。

(3)pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響:將各菌株在不同pH值(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)的K氏液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，45℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)16 h后，以未接種菌種的空白K氏液體培養(yǎng)基作為空白，取菌液于1 cm比色杯利用分光光度計(jì)測(cè)定600 nm處的吸光度，得出菌株在不同pH條件下的生長(zhǎng)情況。

(4)芽孢耐熱性:參考焦中高［9］的方法，將芽孢懸液稀釋至105～106CFU/mL，然后置于90℃水浴中處理，分別取一定量的處理懸液稀釋涂平板，40℃培養(yǎng)3 d后計(jì)數(shù)。以處理時(shí)間為橫坐標(biāo)、存活芽孢數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，作芽孢存活曲線，計(jì)算D90℃值。D90℃值即該菌株芽孢在90℃處理時(shí)存活曲線斜率的負(fù)倒數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜酸耐熱菌的確定

從腐爛蘋果中通過分離、篩選及純化，最終得到2株嗜酸耐熱菌，即分離菌A-1和分離菌A-2，如圖1與圖2所示。

圖1 A-1菌落形態(tài)圖Fig.1 Colonial morphology of strain A-1

圖2 A-2菌落形態(tài)圖Fig.2 Colonial morphology of strain A-2

A-1、A-2經(jīng)過 80℃、10 min的熱處理，均可在402培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，表明有很好的耐熱性;另外均可在K氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，但在LB培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，表明2株分離菌具有耐酸性，初步確定A-1、A-2均為嗜酸耐熱菌。

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察(圖1-圖4)可知，2株分離菌與標(biāo)準(zhǔn)菌的菌落形態(tài)特征及顯微形態(tài)特征十分相似，其形態(tài)描述如表1。

圖3 A-1革蘭氏染色圖Fig.3 Micrograph of strain A-1 by Gram stain

圖4 A-2革蘭氏染色圖Fig.4 Micrograph of strain A-2 by Gram stain

表1 形態(tài)學(xué)特征Table 1 Morphological characteristics

2.3 生理生化鑒定

分離菌A-1、A-2進(jìn)行生理生化試驗(yàn)的結(jié)果如表2所示。A-2氧化酶呈陰性，A-1的肌醇利用呈陰性，其他生理生化指標(biāo)均與標(biāo)準(zhǔn)菌相同，同種微生物不同菌株間可能存在特性的差異，分離菌與標(biāo)準(zhǔn)菌仍具有同屬脂環(huán)酸芽孢桿菌屬的可能性。

表2 生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Results of physiological and biochemical identification

通過對(duì)菌種的形態(tài)觀察和生理生化鑒定，可以得知2株分離菌與標(biāo)準(zhǔn)菌的各項(xiàng)指標(biāo)相似，初步認(rèn)為2株分離菌均屬于脂環(huán)酸芽孢桿菌屬。對(duì)分離的2株菌進(jìn)行分子生物學(xué)分類鑒定，進(jìn)一步確定其分類地位。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

2.4.1 序列比對(duì)結(jié)果

利用細(xì)菌試劑盒提取2株分離菌的DNA，電泳檢測(cè)后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。分離菌的DNA及PCR產(chǎn)物電泳圖見圖5，由圖5可知，PCR產(chǎn)物擴(kuò)增之后得到的序列長(zhǎng)度均在1 500 bp左右。

圖5 DNA及PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.5 DNA electrophoresis and PCR product electrophoresis

2.4.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果在DNAMAN上進(jìn)行拼接，并在GENEBANK上進(jìn)行BLAST比對(duì)，挑選同源性超過99%的基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖6)。由系統(tǒng)發(fā)育樹可知，該菌與酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的同源性可達(dá)到100%，結(jié)合形態(tài)鑒定和生理生化鑒定結(jié)果，最終鑒定A-1、A-2均為酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌。

圖6 分離菌A-1與A-2的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of isolated strains A-1 and A-2

2.5 生長(zhǎng)特性的研究

2.5.1 生長(zhǎng)曲線的繪制

由圖7可知，A-1與標(biāo)準(zhǔn)菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)大致相同，均在4h時(shí)由延遲期進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，8 h時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期;當(dāng)生長(zhǎng)到16 h之后菌體濁度緩慢降低。而A-2生長(zhǎng)速度較快，培養(yǎng)14 h之后營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，菌體濁度緩慢降低。

圖7 菌株生長(zhǎng)曲線Fig.7 Growth curves of standard and isolated strains

2.5.2 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

菌株分別在不同溫度下培養(yǎng)16 h，測(cè)定OD600。由圖8可以看出，A-1、A-2均可在一個(gè)相對(duì)廣泛的溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)。當(dāng)pH為4.0時(shí)，溫度為45℃，A-1、A-2菌體濁度最高，長(zhǎng)勢(shì)最好，可確定為A-1、A-2的最適生長(zhǎng)溫度。

Wisotzkey［10］提出細(xì)胞膜中獨(dú)特的ω-環(huán)己烷脂肪酸結(jié)構(gòu)為脂環(huán)酸芽孢桿菌在酸熱環(huán)境中的生長(zhǎng)提供有利條件。ω-環(huán)己烷脂肪酸作為細(xì)胞的保護(hù)結(jié)構(gòu)，有助于提高細(xì)菌處于高溫環(huán)境和酸性條件的適應(yīng)能力和生存能力。目前脂環(huán)酸芽孢桿菌的耐熱機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步的深入研究與探討。

2.5.3 pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

圖8 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig.8 Effect of temperature on strain growth

菌株在不同pH值條件下分別培養(yǎng)16 h，測(cè)定OD600。由圖9可以看出，A-1、A-2生長(zhǎng)的pH范圍為2.5～6.5。當(dāng)pH值為3.5時(shí)，A-2菌體濁度最高，長(zhǎng)勢(shì)最好，為A-2的最適生長(zhǎng)pH值。當(dāng)pH值為4.0時(shí)，A-1菌體濁度最高，長(zhǎng)勢(shì)最好，為A-1的最適生長(zhǎng)pH值。

圖9 pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig.9 Effect of pH on strain growth

從2株分離菌的生長(zhǎng)pH值范圍和最適生長(zhǎng)pH可以看出，分離菌表現(xiàn)出了對(duì)酸性條件的嗜好性，能較好的耐受酸性條件。因此，只有在酸性條件下該菌才適宜生長(zhǎng)繁殖。

2.5.4 芽孢耐熱性的研究

嗜酸耐熱菌芽孢90℃熱處理，其存活曲線如圖10所示。A-1、A-2的 D90℃分別為11.90 min和13.70 min。A-2的芽孢表現(xiàn)出了比標(biāo)準(zhǔn)菌(D90℃約為13.33 min)更強(qiáng)的耐熱性。

圖10 芽孢存活曲線Fig.10 Survival curves of spores

嗜酸耐熱菌的耐熱性主要體現(xiàn)在芽孢上。在蘋果汁加工過程中，巴氏殺菌或高溫瞬時(shí)滅菌并不能使其芽孢失活，反而刺激了芽孢的萌發(fā)。待條件適宜時(shí)芽孢可在蘋果汁中大量繁殖最終導(dǎo)致蘋果汁的腐敗。

3 結(jié)論

(1)本次實(shí)驗(yàn)經(jīng)形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性驗(yàn)證得到了2株與標(biāo)準(zhǔn)菌A.acidoterrestris CICC 10374具有明顯相似性的嗜酸耐熱菌A-1與A-2，經(jīng)16S rDNA序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分離菌與A.acidoterrestris同源性可達(dá)100%，最終分離菌A-1、A-2均鑒定為酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌。

(2)從腐爛的金帥蘋果中分離到的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌A-1、A-2的最適生長(zhǎng)溫度均為45℃(pH值為4.0)，最適生長(zhǎng)pH值分別為4.0、3.5。90℃熱處理其芽孢，A-1、A-2的D90℃分別為11.90 min和13.70 min，A-2比A-1、標(biāo)準(zhǔn)菌有更強(qiáng)的耐熱性，A-2可作為蘋果汁加工過程品質(zhì)控制的主要對(duì)象進(jìn)一步研究。

［1］ 王峰，李建科，郭玉蓉，等.蘋果濃縮汁中嗜酸耐熱菌的分離與鑒定［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2008，35(11):1 755-1 759.

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