張 珊，賈茜雯，孫士鋒，龐 義，陳其津，楊 凱*

(1.中山大學有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣州 510275;2.華南師范大學附屬中學，廣州 510630;3.廣東海納農(nóng)業(yè)有限公司，廣東惠州 516005)

稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis Guenée 屬于鱗翅目螟蛾科昆蟲，俗名縱卷螟、苞葉蟲、稻縱卷葉蟲等，是一種典型的遷飛性害蟲，寄主有水稻、大麥、小麥、玉米等農(nóng)作物，以及茅草、狗尾草、蘆葦?shù)群瘫究齐s草(洪曉月等，2007)。稻縱卷葉螟在國內(nèi)的分布地區(qū)為東自臺灣，西迄西藏，南起海南島，北到黑龍江，遍及28個省、市、自治區(qū)，南方以及長江中下游種植水稻的區(qū)域受到這種害蟲的危害最為嚴重，目前為水稻的三大害蟲之一(張孝羲等，1980)。

稻縱卷葉螟顆粒體病毒(Cnaphalocrocis medinalis granulovirus，CnmeGV)由中山大學龐義教授等(1981)首次報道。該病毒于1979年秋從廣東省江門市恩平縣晚造水稻田里的罹病稻縱卷葉螟幼蟲中分離，田間宿主的死亡率高達30%-40%，蟲口密度大的田塊尤多(龐義等，1981)。因此，CnmeGV 是一種很有潛力的生物防治劑，可以用來控制稻縱卷葉螟的發(fā)生，減輕對水稻的危害。

桿狀病毒是專一性感染昆蟲的病毒，基因組為大型閉合環(huán)狀雙鏈DNA，衣殼呈桿狀，具有嚢膜包被，病毒粒子包埋于包涵體中(Rohrmann，2013)。顆粒體病毒(granulovirus，GV)是桿狀病毒的一個屬，其包涵體為卵圓形，直徑在200-400 nm 之間，一般僅包埋單個桿狀的病毒粒子(Rohrmann，2013)。目前已分離的GV 共有148 株(Rohrmann，2013)，而收錄在GenBank 中的全基因組序列已測定的GV 僅有17 株(Rohrmann et al.，2013;Zhang et al.，2014;Zhu et al.，2014)。

CnmeGV 是根據(jù)首次分離到該病毒的宿主名稱來命名的，這是普遍采取的一種命名病毒的方法。但是有些桿狀病毒可以感染不同的宿主，因此在GenBank 中有些不同名稱的病毒事實上是同一種病毒(Rohrmann，2013)。所以新分離病毒在開展全基因組序列測定之前，最好先進行分子水平上的鑒定。lef-8 和lef-9 基因編碼桿狀病毒RNA 聚合酶的兩個亞基(Guarino et al.，1998;Herniou et al.，2003)。gran 基因編碼GV 包涵體中主要的基質(zhì)蛋白(de Moraes and Maruniak，1997;Zanotto et al.，1993)。以前的研究發(fā)現(xiàn)，由gran、lef-8和lef-9 基因部分融合序列推導的進化樹與用桿狀病毒核心基因融合序列推導的系統(tǒng)發(fā)育樹在拓撲結(jié)構(gòu)上完全一致(Lange et al.，2004;Jehle et al.，2006)。

本研究利用稻縱卷葉螟幼蟲在實驗室中成功增殖了CnmeGV，并擴增出CnmeGV 的gran、lef-8 和lef-9 片段，利用MEGA4 軟件進行了系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，GenBank 中沒有CnmeGV 序列報道。此外，本研究還對幾個地區(qū)的稻田的CnmeGV 流行病學進行了初步的調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒

CnmeGV:于1979年采自江門市恩平縣晚造水稻罹病稻縱卷葉螟幼蟲，在栽有水稻的罩籠內(nèi)飼養(yǎng)幼蟲并擴增病毒后，4℃保存于本實驗室(蒲蟄龍等，1986)。

1.1.2 昆蟲

稻縱卷葉螟:2012年5月中旬-7月下旬，采自廣州市岑村華南農(nóng)業(yè)大學水稻試驗田內(nèi)的野生種群，室內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，溫度為(26±0.5)℃，相對濕度為90%-95%，光周期為光∶暗=16 h∶8 h。

1.2 方法

1.2.1 CnmeGV 的增殖

選取3-4 齡稻縱卷葉螟幼蟲放入飼養(yǎng)盒中饑餓4-5 h，喂以混合CnmeGV 的水稻汁液。覆蓋新鮮水稻葉片，滴加1 mL 滅菌ddH2O，有孔保鮮膜封閉，濕潤棉球保濕。拍照記錄感染病毒后稻縱卷葉螟的病癥(如圖1)。

1.2.2 病毒包涵體的純化

向染病死亡的蟲尸中加入適量的PBS(pH=7.4)，研磨并用四層紗布過濾。經(jīng)差速離心和蔗糖密度梯度離心，獲得純化的CnmeGV 包涵體(O'Reilly et al.，1992)。

1.2.3 PCR 擴增gran、lef-8、lef-9 基因片段及序列測定

參照(O'Reilly et al.，1992)從包涵體中提取病毒DNA。PCR 擴增gran、lef-8 及l(fā)ef-9 基因片段，引物序列見(Jehle et al.，2006)。由上海Invitrogen 生物工程公司完成擴增片段的序列測定。Seqman 5.01 軟件對雙向測序結(jié)果進行拼接、校對、去除通用引物。

1.2.4 系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹的桿狀病毒包括CnmeGV、14 株已測序GV，以及作為外類群的苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)。除CnmeGV外，其余病毒的gran、lef-8 及l(fā)ef-9 基因序列均下載自GenBank(Ayres et al.，1994;Escasa et al.，2006;Ferrelli et al.，2012;Harrison et al.，2008;Liang et al.，2011;Wormleaton et al.，2003;Zhang et al.，2012)。將下載序列導入MEGA4 軟件，對序列進行多重比對和融合，選擇UPGMA 法則，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，并對各分支節(jié)點進行Bootstrap 檢驗(檢測1000 次，每次檢測隨機加樣重復100次)。

1.2.5 稻縱卷葉螟樣品的采集和體內(nèi)CnmeGV 的分子生物學檢測

采集地點為華南農(nóng)業(yè)大學試驗田(廣州市岑村)、惠州市新崗村、惠州市萬蘆村、江門市恩平縣、湖北省潛江市。采集幼蟲蟲苞，將蟲苞分為兩部分:一部分分裝于保鮮袋中，在實驗室內(nèi)飼養(yǎng)4-5 d 后，觀察是否有感染死亡的稻縱卷葉螟幼蟲，并統(tǒng)計發(fā)病率;一部分在田間剝開，將單頭幼蟲放入95%乙醇中，每個地點取樣20 頭。在實驗室提取稻縱卷葉螟DNA(Chai et al.，2011)。PCR 檢測蟲體內(nèi)是否存在CnmeGV 的lef-8 基因片段。

圖1 實驗室增殖CnmeGVFig.1 Propagation of CnmeGV in laboratory

2 結(jié)果與分析

2.1 稻縱卷葉螟幼蟲感染CnmeGV 的病癥

感染CnmeGV 后，稻縱卷葉螟幼蟲從正常的半透明狀態(tài)逐漸變成灰白色，進而變成白色不透明體或者略帶橙黃色，行動遲緩。罹病前期和中期仍能卷葉取食，但食欲減退。病蟲多數(shù)不能化蛹，即使化蛹也會在蛹期死亡。幼蟲一般在感染病毒后5-10 d 死亡，剛死亡時蟲體為乳白色，體內(nèi)液化(如圖2-C)。用槍頭反復吹打蟲尸，可釋放出含病毒的體液，而蟲皮保持完整(如圖2-E)。如蟲尸在室溫放置1-2 d，蟲體將完全液化，且呈現(xiàn)紫醬色(如圖2-D)。

2.2 基于gran、lef-8 及l(fā)ef-9 基因融合序列的系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建和分析

基于gran、lef-8 及l(fā)ef-9 基因部分序列，我們構(gòu)建了UPGMA 融合系統(tǒng)發(fā)生樹。如圖3 所示，系統(tǒng)發(fā)生樹節(jié)點處數(shù)值表示該分支的相對置信度，該樹的置信度較高，只有兩個節(jié)點的數(shù)值在50%以下。而單獨以gran、lef-8 以及l(fā)ef-9 基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹分支的置信度普遍低于50%(結(jié)果未顯示)。

圖2 稻縱卷葉螟幼蟲感染CnmeGV 后的形態(tài)學病征觀察Fig.2 The symptoms of C.medinalis larvae infected with CnmeGV

圖3 基于gran、lef-8 和lef-9 基因部分融合序列的UPGMA 系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.3 UPGMA distance tree based on concatenated DNA sequences of the partial gran，lef-8 and lef-9 genes

由圖3 可知，CnmeGV 和茶小卷葉蛾顆粒體病毒(Adoxophyes orana granulovirus，AdorGV)是一個單系類群的幾率為93%(單系類群是指包含一個祖先類群的所有子裔的群組)，即CnmeGV 和AdorGV 由同一祖先進化而來的概率為93%。在所有全基因組已測序的GV 中，與CnmeGV 親緣關(guān)系最近的是AdorGV，進化距離為它們各自到最近節(jié)點的分支長度的和，約為0.35，且AdorGV 與CnmeGV 的gran、lef-8 和lef-9 融合基因在軟件MegAlign 里比對后顯示相似度只有59.8%。兩種結(jié)果都表明與 CnmeGV 親緣關(guān)系最近的為AdorGV，但相似度不高，可以確定CnmeGV 是一個未收錄在GenBank 中的獨立病毒株，為一個新種。

圖3 中還顯示宿主為卷葉蛾科幼蟲的GV 除了大豆葉小卷蛾顆粒體病毒(Epinotia aporema granulovirus，EpapGV)之外，都集中分布在系統(tǒng)發(fā)生樹的同一支內(nèi)，且節(jié)點處有81%的置信度，而宿主為螟蛾科幼蟲的CnmeGV 也被分在了這一支內(nèi)，有可能是因為CnmeGV 是在進化的過程中從其他卷葉蛾幼蟲體內(nèi)轉(zhuǎn)移到稻縱卷葉螟體內(nèi)的。宿主為夜蛾科幼蟲的GV 大部分也被分在了同一支內(nèi)，如棉鈴蟲顆粒體病毒(Helicoverpa armigera granulovirus，HearGV)、八字地老虎顆粒體病毒(Xestia c-nigrum granulovirus，XecnGV)、美洲粘蟲顆粒體病毒(Pseudelatia unipuncta granulovirus，PsunGV)和斜紋夜蛾顆粒體病毒(Spodoptera litura granulovirus，SpltGV)這一類群為單系類群的概率為100%，即它們是由共同祖先進化而來的概率為100%，其中HearGV 與XecnGV 親緣關(guān)系極近，進化距離只有0.02 左右。系統(tǒng)發(fā)生樹的分支情況顯示GV 的分支與宿主是存在一定的聯(lián)系的，病毒與宿主之間存在一定的協(xié)同進化關(guān)系。

2.3 CnmeGV 流行病學初步調(diào)查結(jié)果

分別從廣州市岑村、惠州市萬蘆村、惠州市新崗村、湖北省潛江市和江門市恩平縣采集稻縱卷葉螟幼蟲，觀察是否有CnmeGV 感染。在實驗室飼養(yǎng)5-6 d 后，從江門市恩平縣采集的幼蟲出現(xiàn)了病毒感染死亡的癥狀，死亡率達36.7%(如表2)。抽提蟲尸內(nèi)的病毒基因組，利用上述lef-8基因引物，通過PCR 擴增可得到一DNA 片段(如圖4)。序列比對表明，擴增片段的核苷酸序列與之前實驗室保存的CnmeGV 擴增出的lef-8 基因序列完全一致，證明該病毒為CnmeGV。其他四個地區(qū)所采集的稻縱卷葉螟幼蟲沒有出現(xiàn)病毒感染的癥狀，PCR 未檢測到蟲體內(nèi)存在CnmeGV 的lef-8片段(如圖5)，表明所檢測的四個地區(qū)的稻縱卷葉螟種群中可能不存在CnmeGV。

3 結(jié)論與討論

本實驗室將從田間采集的稻縱卷葉螟成蟲放置在栽有水稻的罩籠內(nèi)，產(chǎn)卵，待孵化幼蟲進入二齡后，噴以CnmeGV 致死蟲尸的懸浮液，使幼蟲感染并擴增CnmeGV(蒲蟄龍等，1986)。本研究建立了一種在實驗室方便快捷地擴增CnmeGV的新方法。將采集的稻縱卷葉螟幼蟲在飼養(yǎng)盒中饑餓處理4-5 h，喂以混合CnmeGV 的水稻汁液，水稻汁液具備清新水稻氣味，能夠吸引饑餓的幼蟲取食。在覆蓋新鮮水稻葉片后，加滅菌ddH2O、濕潤棉球以及有孔保鮮膜，不僅可以保證水稻葉片的新鮮，還可以維持稻縱卷葉螟生長的濕潤環(huán)境。

表1 不同地區(qū)稻縱卷葉螟自然染病死亡率統(tǒng)計Table 1 The natural mortality rate of wild C.medinalis larvae collected from different places

圖4 江門市恩平縣稻縱卷葉螟幼蟲體內(nèi)CnmeGV 的檢測Fig.4 Electrophoretogram of PCR products amplified from the C.medinalis larvae collected from Jiangmen Enping

圖5 不同地區(qū)稻縱卷葉螟幼蟲體內(nèi)CnmeGV 的檢測Fig.5 Electrophoretogram of PCR products amplified from the C.medinalis larvae collected from different locations

根據(jù)感染昆蟲宿主的組織趨向性不同，GV 可以被分為三種類型:Type 1 型GV 代表種為粉紋夜蛾顆粒體病毒(Trichoplusia ni granulovirus，TnGV)，感染局限于宿主的中腸和脂肪體，不能侵染表皮和氣管皮膜組織等重要的組織，幼蟲死亡時蟲體僅有一點或者是完全沒有液化的現(xiàn)象;Type 2 型GV 代表種為蘋果小蠹蛾顆粒體病毒(Cydia pomonella granulovirus，CpGV)，這類病毒感染的途徑和染病后蟲體的病癥與典型的鱗翅目核多角體病毒病類似，在侵染中腸后，能夠侵染包括表皮、脂肪體和氣管皮膜組織等蟲體的主要組織，隨著感染時間的增長，幼蟲逐漸出現(xiàn)輕微的腫脹，并且在表皮下方有不規(guī)則的黃白色斑塊，死后蟲體會液化;Type 3 型GV 只有唯一的一株葡萄葉斑蛾顆粒體病毒(Harrisina brillians granulovirus，HbGV)，這種病毒只感染宿主的中腸上皮組織，導致宿主因中腸上皮細胞的大量脫落影響排泄系統(tǒng)而快速死亡(Federici，1997)。本研究對稻縱卷葉螟幼蟲感染CnmeGV 的病癥進行了細致的觀察，發(fā)現(xiàn)感染蟲體的大部分組織均被CnmeGV 侵染，但沒有完全液化，這與Type2 型的GV 所表現(xiàn)出來的特征相近。

昆蟲流行病學是研究昆蟲種群疾病的成因和形式的一門科學，主要內(nèi)容包括:與疾病流行有關(guān)的寄主昆蟲種群問題，病原微生物問題，疾病的感染、傳播和流行因素等問題(蒲蟄龍，1992)。昆蟲疾病的流行因素主要有生物因素和氣象因素，其中生物因素包括病原微生物的致病力和傳染力、寄主昆蟲的生理狀態(tài)、生活習性和密度以及鳥類等昆蟲天敵;氣象因素包括陽光、溫度、濕度、風、雨等(蒲蟄龍，1992)。本研究通過對五個地區(qū)CnmeGV 流行病學的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)僅江門市恩平縣采集的稻縱卷葉螟幼蟲出現(xiàn)了因感染CnmeGV 而死亡的現(xiàn)象，而此地恰好是1979年首次發(fā)現(xiàn)該病毒的地區(qū)。此外，本次調(diào)查的稻縱卷葉螟的死亡率與以前報道的一致，表明該病毒與區(qū)域生態(tài)環(huán)境能夠和諧共存。其他四個地區(qū)未檢測到有CnmeGV 的存在，說明CnmeGV 沒有流行到這些地區(qū)，從某個角度反應了該病毒的流行傳播能力不是很強，可以進一步通過大范圍的采樣來調(diào)查分析。

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