張 鵬，李 慧，王秋紅，陳澄宇，慕 衛(wèi)，劉 峰

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，農(nóng)藥毒理與應(yīng)用技術(shù)省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安 271018)

韭菜遲眼蕈蚊Bradysia odoriphaga Yang et Zhang 俗稱韭蛆，是我國(guó)北方蔬菜生產(chǎn)上的一種重要害蟲，其發(fā)生范圍廣，危害重，防治困難。由于常規(guī)殺蟲劑對(duì)其田間防治效果不理想，導(dǎo)致一些地方菜農(nóng)在韭菜上大量使用高毒、劇毒、長(zhǎng)殘留殺蟲劑防治該蟲，給人類身體健康帶來嚴(yán)重威脅。隨著全社會(huì)對(duì)綠色無公害蔬菜需求的增加，篩選高效、低毒、低殘留的防治藥劑成為當(dāng)前的首要目標(biāo)。目前韭蛆的室內(nèi)生測(cè)方法主要有浸蟲法(賈海民，2000)、胃毒觸殺聯(lián)合毒力法(慕衛(wèi)，2002)兩種。這兩種方法在試蟲齡期、試蟲飼養(yǎng)條件(溫度、飼料等)、浸藥和調(diào)查時(shí)間等方面均缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)(賈海民，2000;慕衛(wèi)，2002，2004，2005;王萍，2011;張思聰，2011;李娜娜，2012)，如賈海民等(2000)采用4 齡幼蟲，應(yīng)用浸漬法將供試幼蟲在藥液中浸漬30 s，移到蔥白上培養(yǎng)48 h 檢查試驗(yàn)結(jié)果;慕衛(wèi)等(2002)室內(nèi)采用韭菜段飼養(yǎng)韭蛆至3 齡幼蟲，然后用蘸有藥液的濾紙加藥液浸泡15 s 后的韭菜段測(cè)定殺蟲劑的毒力，藥后72 h 檢查結(jié)果;張思聰?shù)?2011)采用人工飼料飼養(yǎng)韭蛆至2 齡幼蟲用于藥劑毒力測(cè)定。處理方法及試蟲條件的不一致不利于藥劑的毒力評(píng)價(jià)和篩選。

溫度不僅影響昆蟲各蟲態(tài)發(fā)育歷期，還影響其體內(nèi)生理代謝機(jī)能，尤其是與藥劑相關(guān)的一系列靶標(biāo)酶和代謝解毒酶的變化會(huì)直接影響昆蟲對(duì)藥劑的敏感性。吳剛(2008)等報(bào)道了測(cè)試溫度對(duì)小菜蛾、菜縊管蚜和寄生蜂乙酰膽堿酯酶對(duì)藥劑敏感性的影響，龔忱(2011)等報(bào)道了溫度對(duì)擬環(huán)紋豹蛛乙酰膽堿酯酶體軀分布的影響，但試蟲的飼養(yǎng)溫度對(duì)藥劑敏感性的影響尚未見報(bào)道。從田間不同寄主植物上采自或選取室內(nèi)飼喂不同食料的試蟲進(jìn)行藥劑測(cè)定，可能會(huì)因食物營(yíng)養(yǎng)成分不同而導(dǎo)致其體內(nèi)與藥劑相關(guān)的靶標(biāo)酶系、解毒酶系在質(zhì)(結(jié)構(gòu))或量(酶量)上發(fā)生變化(欽俊德，1987;張勇，2005)。Swingle(1939)發(fā)現(xiàn)南方灰翅夜蛾幼蟲取食不同寄主植物葉片后，對(duì)砷化物的敏感性發(fā)生了變化;張勇(2005)等發(fā)現(xiàn)取食不同寄主的棉鈴蟲對(duì)溴氰菊酯和高效氯氰菊酯的敏感性以及其體內(nèi)代謝酶活性都發(fā)生顯著變化;薛明(2005a，2005b)等采用韭菜、大蔥、圓蔥、大蒜室內(nèi)飼喂韭蛆幼蟲發(fā)現(xiàn)對(duì)其存活率影響較大，且對(duì)辛硫磷的敏感性也有差異。此外，試蟲齡期也影響其對(duì)藥劑的敏感性(陳丙坤，2009)。為此，本試驗(yàn)研究了齡期、飼養(yǎng)條件、生測(cè)方法等因素對(duì)韭蛆生測(cè)結(jié)果的影響，旨在為防治藥劑的篩選和科學(xué)評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試蟲

于2012年11月，從山東省章丘市有機(jī)韭菜基地采集韭菜遲眼蕈蚊幼蟲(韭蛆)，帶回實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行人工飼養(yǎng)。采用慕衛(wèi)(2003)設(shè)計(jì)的韭菜遲眼蕈蚊人工飼養(yǎng)方法擴(kuò)大繁殖后取適齡幼蟲供試。飼養(yǎng)條件為溫度25±1℃，濕度75±5%，自然光照。

1.2 飼料

韭菜(漢中韭)、大蔥(中華巨蔥)、圓蔥(紅太陽(yáng)圓蔥)、人工飼料(主要成分:蘑菇粉、韭菜粉、酵母粉、瓊脂粉、防腐劑、維生素、水)根據(jù)于毅(2009)等人專利的制作工藝進(jìn)行配制。

1.3 供試藥劑

97%毒死蜱(Chlorpyrifos)原藥(山東天成農(nóng)藥有限公司)、94%噻蟲胺(Clothianidin)原藥(日本住友化學(xué)株式會(huì)社)。將各原藥參考國(guó)標(biāo)的方法配制成簡(jiǎn)單劑型或母液。詳細(xì)配制方法為40%毒死蜱乳油母液:41.2% 原藥，48.8% 二甲苯，4.5%農(nóng)乳500#，5.5%農(nóng)乳600#;1%噻蟲胺懸浮劑母液:1.04%原藥，2%寧乳34#，0.20%黃原膠，96.76%去離子水，混合后加入鋯珠，研磨2 h 制得。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 胃毒觸殺聯(lián)合毒力法

將潔凈濾紙平鋪在直徑9 cm 的培養(yǎng)皿內(nèi)，在濾紙上滴加1.2 mL 藥液。將未用藥的韭菜莖基的白色部分剪成1 cm 小段，取4 段于不同濃度藥液中浸泡30 s 后取出，用吸水紙上吸去多余藥液后置于鋪有相同藥液處理濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，然后用毛筆輕輕挑取大小一致的適齡幼蟲放于培養(yǎng)皿內(nèi)，并蓋好皿蓋。每皿接入試蟲25 頭左右，每處理重復(fù)3 次，同時(shí)設(shè)清水對(duì)照。放入25±1℃、相對(duì)濕度75±5%的無光培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。藥后一定時(shí)間檢查結(jié)果，以毛筆尖輕觸蟲體，幼蟲不動(dòng)或身體明顯收縮者記為死亡。

1.4.2 人工飼料混藥法

本實(shí)驗(yàn)室參照《農(nóng)藥室內(nèi)生物測(cè)定試驗(yàn)準(zhǔn)則》(2006)中的人工飼料混藥法，并加以改進(jìn)。具體方法為:稱取已熔化的韭蛆人工飼料4.5 g，將稀釋好的待測(cè)藥劑母液0.5 g 均勻混入制作好的人工飼料中，制成混藥飼料，待飼料凝固后切成0.5 cm3的小塊。將藥劑母液分別稀釋10 倍，取1.0 mL 均勻滴加于平鋪在直徑9 cm 培養(yǎng)皿內(nèi)的濾紙上。將切好的混藥人工飼料小塊置于鋪有相同濃度藥液處理濾紙的培養(yǎng)皿中央，然后將生長(zhǎng)一致聚集成團(tuán)的適齡幼蟲用毛筆輕輕挑至培養(yǎng)皿飼料小塊上。每皿接入試蟲25 頭左右，每處理重復(fù)3 次，同時(shí)設(shè)清水對(duì)照。其他試驗(yàn)操作、試驗(yàn)條件及結(jié)果檢查同1.4.1。

1.4.3 浸蟲法

將濾紙折成漏斗狀，用毛筆輕輕挑起聚集成團(tuán)且大小一致的適齡幼蟲于濾紙中心，再用移液管吸取藥液滴于漏斗中，幼蟲在藥液中浸泡30 s后，用吸水紙吸去漏斗中多余藥液。將浸過藥液的試蟲用毛筆挑放在墊有干凈濾紙(未用藥液處理)的9 cm 培養(yǎng)皿內(nèi)，濾紙上定量加水1.2 mL以保濕，放入新鮮韭菜莖段作飼料。每皿接入試蟲25 頭左右，每處理重復(fù)3 次，同時(shí)設(shè)清水對(duì)照。其他試驗(yàn)操作、試驗(yàn)條件及結(jié)果檢查同1.4.1。

1.5 不同齡期韭蛆的毒力測(cè)定

分別采用2 齡和4 齡幼蟲，以毒死蜱為試驗(yàn)藥劑分別用胃毒觸殺聯(lián)合毒力法、人工飼料混藥法和浸蟲法進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定，重復(fù)3 次。

1.6 食料對(duì)韭蛆4 齡幼蟲生測(cè)毒力的影響

分別取人工飼料、韭菜假莖、大蔥植株近根部的地下莖和圓蔥頭作飼料，在室內(nèi)分別連續(xù)飼養(yǎng)韭蛆至第二代，選取第二代4 齡幼蟲采用胃毒觸殺聯(lián)合毒力法對(duì)毒死蜱、噻蟲胺進(jìn)行4 齡幼蟲的室內(nèi)生測(cè)試驗(yàn)，重復(fù)3 次。

1.7 飼養(yǎng)溫度對(duì)韭蛆4 齡幼蟲生測(cè)毒力的影響

設(shè)定4個(gè)溫度梯度，在15℃、20℃、25℃、30℃飼養(yǎng)試蟲至第二代，采用胃毒觸殺聯(lián)合毒力法在25℃下進(jìn)行毒死蜱對(duì)韭蛆4 齡幼蟲的室內(nèi)生測(cè)試驗(yàn)。

1.8 生測(cè)方法對(duì)韭蛆4 齡幼蟲生測(cè)毒力的影響

采用胃毒觸殺聯(lián)合毒力法、人工飼料混藥法和浸蟲法對(duì)毒死蜱、噻蟲胺進(jìn)行不同作用方式的室內(nèi)毒力評(píng)價(jià)，以4 齡幼蟲進(jìn)行室內(nèi)生測(cè)試驗(yàn)，重復(fù)3 次。

1.9 數(shù)據(jù)分析

生測(cè)數(shù)據(jù)采用DPS v7.05 軟件分析整理(唐啟義，2002)。同一生測(cè)方法不同齡期的敏感性倍數(shù)，以毒死蜱對(duì) 4 齡試蟲的致死中濃度LC50(mg/L)為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算毒死蜱對(duì)二齡試蟲的LC50比值。同一方法同一藥劑處理不同飼料飼養(yǎng)的韭蛆4 齡幼蟲根據(jù)致死中濃度LC50(mg/L)，以毒死蜱對(duì)圓蔥飼養(yǎng)的試蟲的LC50為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算毒死蜱對(duì)其余3種飼料飼養(yǎng)試蟲的LC50比值，以噻蟲胺對(duì)韭菜飼養(yǎng)的試蟲的LC50為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算噻蟲胺對(duì)其余3種飼料飼養(yǎng)試蟲的LC50比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼蟲齡期及生測(cè)方法對(duì)藥劑毒力的影響

表1 結(jié)果表明，對(duì)于同齡幼蟲，三種方法測(cè)得的LC50值均以浸蟲法最高，人工飼料混藥法次之，胃毒觸殺聯(lián)合毒力法最低;人工飼料混藥法和胃毒觸殺聯(lián)合毒力法測(cè)得的LC50值差異性不顯著。4 齡幼蟲對(duì)藥劑的耐受力顯著高于2 齡幼蟲。胃毒觸殺聯(lián)合毒力法、人工飼料混藥法和浸蟲法測(cè)得2 齡幼蟲對(duì)毒死蜱的敏感性倍數(shù)分別為4 齡幼蟲的11.9 倍、7.4 倍、3.3 倍。說明韭蛆幼蟲齡期影響藥劑毒力。

表1 三種生測(cè)方法測(cè)定毒死蜱對(duì)2 齡和4 齡幼蟲的毒力Table 1 The toxicities of chlorpyrifos on 2nd and 4th instar larvae by three different bioassay methods

2.2 不同食料飼喂韭蛆對(duì)藥劑毒力的影響

采用韭菜、大蔥、圓蔥、人工飼料飼養(yǎng)的試蟲，測(cè)定毒死蜱、噻蟲胺對(duì)韭蛆4 齡幼蟲的毒力，結(jié)果結(jié)果見表2。不同食料飼養(yǎng)的韭蛆對(duì)兩種藥劑的敏感性存在較大差異。毒死蜱對(duì)取食韭菜、大蔥、圓蔥和人工飼料的韭蛆4 齡幼蟲的LC50分別為69.399 mg/L、86.801 mg/L、127.965 mg/L、55.158 mg/L，取食韭菜、大蔥、人工飼料的毒力分別為圓蔥的1.84 倍、1.47 倍、2.31 倍。其中取食人工飼料的韭蛆對(duì)毒死蜱最為敏感，取食韭菜、大蔥的較前者敏感性降低。噻蟲胺對(duì)取食韭菜、大蔥、圓蔥和人工飼料的韭蛆4 齡幼蟲的LC50分別為3.445 mg/L、2.850 mg/L、2.093 mg/L、3.092 mg/L，其中取食圓蔥的對(duì)毒死蜱最為不敏感，取食韭菜、大蔥及人工飼料的較前者敏感性升高。

表2 毒死蜱、噻蟲胺對(duì)不同食料飼養(yǎng)幼蟲的毒力Table 2 The toxicities to 4th instar larvae reared on different diets of chlorpyrifos and clothianidin

2.3 不同溫度下飼養(yǎng)韭蛆對(duì)藥劑毒力的影響

采用胃毒觸殺聯(lián)合毒力法測(cè)定了毒死蜱對(duì)不同溫度下飼養(yǎng)韭蛆的毒力(表3)。48h 毒死蜱的LC50值分別113.680 mg/L、154.299 mg/L、224.190 mg/L、254.533 mg/L，72 h 的LC50值分別為35.891 mg/L、56.362 mg/L、71.433 mg/L、77.413 mg/L。在15-30℃，隨飼養(yǎng)溫度的升高毒死蜱的LC50值增大，但增大的幅度不斷減小。從表3 中還可以看出，4個(gè)溫度梯度飼養(yǎng)的試蟲在藥后48 h 的LC50與藥后72 h 的LC50依次相差2.17 倍、1.74 倍、2.15 倍、2.29 倍。

表3 毒死蜱對(duì)不同溫度下飼養(yǎng)的韭蛆4 齡幼蟲的毒力Table 3 The toxicities to 4th instar larvae on different rearing temperatures to chlorpyrifos

2.4 不同生測(cè)方法測(cè)得的藥劑對(duì)韭蛆4 齡幼蟲的毒力

結(jié)果見表4。三種生測(cè)方法胃毒觸殺聯(lián)合毒力法、人工飼料混藥法和浸蟲法對(duì)韭蛆4 齡幼蟲的LC50存在差異。三種測(cè)定方法測(cè)得毒死蜱對(duì)4 齡幼蟲的LC50分別為67.199 mg/L、71.123 mg/L 和88.120 mg/L。噻蟲胺對(duì)4 齡幼蟲LC50分別為3.584 mg/L、2.255 mg/L、4.329 mg/L?？梢?，胃毒觸殺聯(lián)合毒力法測(cè)得的毒死蜱對(duì)4 齡幼蟲的LC50最小，人工飼料混藥法次之，浸蟲法最高;而人工飼料混藥測(cè)得的噻蟲胺對(duì)4 齡幼蟲的LC50最低，胃毒觸殺聯(lián)合毒力法次之，浸蟲法最高。胃毒觸殺聯(lián)合毒力法和人工飼料混藥法測(cè)得毒死蜱的LC50差異性不顯著，但兩者均明顯高于浸蟲法測(cè)得毒死蜱的LC50。三種方法測(cè)得噻蟲胺的LC50存在明顯差異。將兩種藥劑用不同生測(cè)方法所測(cè)得的毒力回歸直線經(jīng)擬合度卡方值檢驗(yàn)，結(jié)果(卡方值均小于F0.05=7.82，P 均大于0.05)顯示三種生測(cè)方法測(cè)得毒力回歸直線都是合適的，但在浸蟲法測(cè)得的毒力回歸直線的擬合度要均比其他兩種方法低(F浸蟲法=1.5557＞F胃毒觸殺聯(lián)合毒力法=0.7564＞F人工飼料混藥法=0.3013;F'浸蟲法=1.2743＞F'胃毒觸殺聯(lián)合毒力法=0.8437＞F'人工飼料混藥法=0.8386)。

表4 三種不同生測(cè)方法對(duì)韭蛆4 齡幼蟲對(duì)毒死蜱、噻蟲胺生測(cè)毒力曲線和LC50的影響Table 4 Effects of toxicity curve and LC50to 4th instar larvae on three different bioassay methods

(續(xù)上表)

3 結(jié)論與討論

不同齡期試蟲對(duì)藥劑的敏感性存在顯著差異。本研究采用胃毒觸殺聯(lián)合毒力法、人工飼料混藥法、浸蟲法測(cè)得2 齡幼蟲對(duì)毒死蜱的敏感性分別為4 齡幼蟲的11.9 倍、7.4 倍、3.3 倍。浸蟲法測(cè)得的毒力敏感性差異最小，可能與其只體現(xiàn)了毒死蜱的觸殺作用，而胃毒作用在韭蛆致死效應(yīng)中起更大作用有關(guān)。另外試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，2 齡幼蟲體型偏小，操作不便，容易因機(jī)械外力而死亡，且存在檢查結(jié)果時(shí)其中毒癥狀難觀察、死亡與否難以判定等問題。這與Cloyd(2006)等人在研究新煙堿類殺蟲劑、蘇云金桿菌對(duì)眼蕈蚊Bradysia spp.(Diptera:Sciaridae)的防治效果時(shí)建議不宜采用2齡幼蟲進(jìn)行試驗(yàn)的解釋是一致的。

毒死蜱屬于有機(jī)磷類殺蟲劑，作用靶標(biāo)是乙酰膽堿酯酶，其敏感度降低是昆蟲對(duì)該類殺蟲劑產(chǎn)生抗性的重要機(jī)制。薛明(2005b)等研究發(fā)現(xiàn)大蔥、圓蔥中含有硫醚類物質(zhì)對(duì)韭蛆體內(nèi)乙酰膽堿酶和代謝酶的誘導(dǎo)或抑制是引起藥劑敏感性差異的重要原因。韭蛆幼蟲長(zhǎng)時(shí)間取食韭菜、人工飼料、大蔥、圓蔥后，其體內(nèi)乙酰膽堿酶和代謝酶可能存在質(zhì)或量的差異，導(dǎo)致毒死蜱對(duì)4種食料飼養(yǎng)的幼蟲毒力顯著差異。而噻蟲胺屬于新煙堿類殺蟲劑，此類藥劑作用于煙堿型乙酰膽堿受體。噻蟲胺對(duì)取食上述4種食料幼蟲的毒力存在差異，但其毒力大小順序與毒死蜱的不同。因此，推測(cè)兩種藥劑表現(xiàn)出的差異可能與其作用機(jī)制有關(guān)。這種取食方面的差異對(duì)藥劑對(duì)試蟲敏感性的影響與張勇(2005)、Swingle(1939)、吳承春(2003)等人的研究結(jié)論一致。

溫度不僅影響韭蛆各蟲態(tài)的發(fā)育歷期，還影響其體內(nèi)的生理代謝功能。本試驗(yàn)在測(cè)定不同飼養(yǎng)溫度對(duì)毒力的影響時(shí)，采用了同一生測(cè)溫度。根據(jù)龔忱(2011)、吳剛(2003)等分別報(bào)道的溫度對(duì)乙酰膽堿酯酶的體軀分布和藥劑敏感性的影響的研究結(jié)果，本試驗(yàn)中飼養(yǎng)溫度對(duì)乙酰膽堿酯酶在韭蛆體軀的分布及含量可能也存在影響，從而導(dǎo)致了毒死蜱對(duì)不同溫度下飼養(yǎng)韭蛆的毒力變化，具體的生理生化機(jī)制還需要進(jìn)一步探討。室內(nèi)飼養(yǎng)條件(溫度、飼料等)的差異性，會(huì)導(dǎo)致試蟲對(duì)藥劑敏感性的差異。因此，室內(nèi)不同飼養(yǎng)條件下的試蟲測(cè)得藥劑毒力無法進(jìn)行比較，毒力測(cè)定必須選用同等條件下統(tǒng)一飼養(yǎng)的試蟲。

胃毒觸殺聯(lián)合毒力法、人工飼料混藥法和浸蟲法均能夠滿足藥劑對(duì)韭蛆的室內(nèi)毒力測(cè)定要求，但胃毒觸殺聯(lián)合毒力法和人工飼料混藥法優(yōu)于浸蟲法。浸蟲法雖簡(jiǎn)單易行，但對(duì)非觸殺型藥劑毒力測(cè)定不夠準(zhǔn)確;胃毒觸殺聯(lián)合毒力法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度高，但需確保韭菜、大蔥等試驗(yàn)材料來源不受農(nóng)藥污染，需要避免浸藥不充分、浸藥后易腐爛等問題，否則會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果的波動(dòng);而采用改進(jìn)的人工飼料混藥法相對(duì)于胃毒觸殺聯(lián)合毒力法和浸蟲法，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度高，可以作為韭菜短缺時(shí)的一種替代方法。

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