鄭林青，郝少東，張志勇，王進(jìn)忠，楊寶東，張民照

(農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

小菜蛾P(guān)lutella xylostella L.是世界性十字花科植物害蟲(chóng)，該蟲(chóng)發(fā)生代數(shù)多、繁殖速度快、世代重疊嚴(yán)重，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重點(diǎn)的防治對(duì)象。長(zhǎng)久以來(lái)，人們主要以施用殺蟲(chóng)劑作為對(duì)菜蛾的防治手段，但隨著殺蟲(chóng)劑廣泛、大量的使用，加上菜蛾生活史的特殊性，目前菜蛾幾乎對(duì)所有現(xiàn)行殺蟲(chóng)劑都已產(chǎn)生了較高抗藥性(馮夏等，2011;劉霞和牛芳，2013)。靶標(biāo)不敏感是昆蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗藥性的一個(gè)極為重要的生化機(jī)制(李顯春和王蔭長(zhǎng)，1998)。交替使用不同靶標(biāo)的農(nóng)藥是克服菜蛾抗藥性的重要途徑(趙懷玲和尤民生，2001;黃劍和吳文君，2003)。因此，篩選開(kāi)發(fā)具有不同作用機(jī)制的新型殺蟲(chóng)劑對(duì)于長(zhǎng)遠(yuǎn)地解決菜蛾抗藥性問(wèn)題具有重要意義。

斑蝥素(Cantharidin)是一種廣泛存在于鞘翅目芫菁科等昆蟲(chóng)(俗稱(chēng)斑蝥Mylabris phalterata pallas)體內(nèi)的次生代謝物，具有較高的殺蟲(chóng)活性和廣泛的殺蟲(chóng)譜(張志勇等，1996;魏列新等，2007;劉瑞瑞等，2010)，對(duì)菜蛾具有觸殺，胃毒作用(張志勇等，1998)。斑蝥素被飼喂菜蛾后，其胃毒作用部位是試蟲(chóng)中腸，電鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)菜蛾幼蟲(chóng)中腸組織發(fā)生明顯的病變，杯狀細(xì)胞微絨毛脫落、斷裂，細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)壞死，線粒體等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)變性，部分細(xì)胞消融(張雅林等，2003)。斑蝥素觸殺菜蛾后，經(jīng)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)蟲(chóng)體壁表皮層的影響不大，其作用部位是皮細(xì)胞，皮細(xì)胞線粒體內(nèi)嵴會(huì)發(fā)生模糊，出現(xiàn)空泡，表現(xiàn)出與胃毒致死的菜蛾中腸細(xì)胞類(lèi)似的超微結(jié)構(gòu)破壞(陳利平等，2011)。以昆蟲(chóng)細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)一步研究，斑蝥素可以迅速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中(汪麗等，2013)，抑制細(xì)胞增殖(周晗穎等，2012)。受試細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)固縮、胞膜突出、質(zhì)膜膜泡化、DNA 片段化、凋亡小體產(chǎn)生等細(xì)胞凋亡的顯著特征，證明斑蝥素導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生的一系列變化系誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡所致(陳利平等，2008;張來(lái)喜等，2011)。顯然，斑蝥素對(duì)昆蟲(chóng)具有與現(xiàn)行農(nóng)藥不同的致毒機(jī)理。

斑蝥素的主要靶標(biāo)為一系列的磷酸蛋白磷酸磷酸酶(Phosphoprotein phosphatase，PPP)(Honkanen，1993;Hastie et al.，1998;Prickett et al.，2006;Swingle et al.，2007)，其中蛋白磷酸酶2A(Protein phosphatase 2A，PP2A)廣泛參與細(xì)胞代謝，DNA 的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，RNA 的剪切、翻譯，細(xì)胞分化，以及細(xì)胞凋亡等過(guò)程(Janssens et al.，2001;Lechward et al.，2001;Xu et al.，2006)，在PPP 中的含量最高(Cohen，1997)，其基因表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控(Baharians et al.，1998)。PP2A 全酶由一個(gè)二聚體的核心酶和一個(gè)可變化的調(diào)節(jié)亞基B 組成，核心酶又包括催化亞基C 和結(jié)構(gòu)亞基A(Hemmings et al.，1990)。菜蛾作為重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，建立其斑蝥素靶標(biāo)受體PP2A 催化亞基(PP2Ac)基因的表達(dá)系統(tǒng)，可為進(jìn)一步研究其PP2A 的生理功能、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、與斑蝥素的結(jié)合作用原理以及斑蝥素類(lèi)活性物質(zhì)防治鱗翅目害蟲(chóng)的改良應(yīng)用提供重要基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試?yán)ハx(chóng)菜蛾P(guān)lutella xylostella(L)由本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期人工于25±3℃，相對(duì)濕度60%-70%的條件下飼養(yǎng)的敏感種群。

RNeasy Plus Mini Kit、QIAquick Gel Extraction Kit 為QIAGEN 公司產(chǎn)品。rTaq DNA 聚合酶、T4連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶Hind Ⅲ與 BamH Ⅰ、2000 bp DNA Marker、1 kb DNA Ladder、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(低)、pMD18T-simple 載體、均為T(mén)AKARA 公司產(chǎn)品。M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶為Promega公司產(chǎn)品。質(zhì)粒提取試劑盒為北京天根生化公司產(chǎn)品。宿主菌大腸桿菌DH5α 為北京全式金公司產(chǎn)品。細(xì)菌蛋白抽提試劑盒、Ni-Agarose His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒、抗His 標(biāo)簽鼠單克隆抗體、Goat Anti-Mouse IgG HRP 抗體、DAB 顯色試劑盒為北京康為世紀(jì)有限公司產(chǎn)品。蛋白預(yù)染Marker 為北京博爾優(yōu)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。pET-30a 質(zhì)粒、宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)均為本實(shí)驗(yàn)室保存。其他所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù) GenBank 收錄的菜蛾 PP2Ac 基因(GenBank 登錄號(hào):KC558556)的ORF 區(qū)，利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)加入HindⅢ與BamHⅠ酶切位點(diǎn)的引物Px-PP2Ac-Hind Ⅲ、Px-PP2Ac-BamH Ⅰ(表1)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 總RNA 提取與第一鏈cDNA 合成

將4 齡菜蛾幼蟲(chóng)用液氮研磨后，參照RNeasy Plus Mini Kit 試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟提取總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性及核酸微量檢測(cè)儀測(cè)定濃度后，使用反轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV Reverse Transcriptase、引物Oligo(dT)18 合成cDNA 第一鏈。

1.4 PCR 擴(kuò)增目的片段

以菜蛾cDNA 為模板，以Px-PP2Ac-Hind Ⅲ、Px-PP2Ac-BamHⅠ為引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;94℃30 s，54℃30s，72℃1 min，35個(gè)循環(huán);72℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后使用l%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并使用QIAquick Gel Extraction Kit 對(duì)目的片段進(jìn)行回收，將回收產(chǎn)物按照pMD18T-simple 載體說(shuō)明進(jìn)行連接，之后轉(zhuǎn)入DH5α 內(nèi)，藍(lán)白班篩選后挑取單克隆菌落培養(yǎng)，經(jīng)PCR 鑒定后的陽(yáng)性菌液送至北京中科希林生物技術(shù)公司測(cè)序。

1.5 pET30a-PP2Ac 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將含有目的基因的T 載體和原核表達(dá)載體pET-30a 的質(zhì)粒分別用Hind Ⅲ和BamH I 進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)l%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和膠純化后使用T4 連接酶進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α，卡那霉素(50μg/mL)抗性平板篩選。抗性菌落的質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后命名為pET30a-PXPP2Ac。提取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)卡那霉素抗性平板篩選后，保存抗性菌落用于重組蛋白的表達(dá)。

1.6 重組PP2Ac 蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化及分析

為了獲得大量的重組蛋白，通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)劑IPTG的濃度及誘導(dǎo)溫度的調(diào)整，篩選最佳的表達(dá)條件。

1.6.1 IPTG 誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化取過(guò)夜培養(yǎng)的含重組質(zhì)粒的菌液，按1∶50稀釋到含卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37℃，180 rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5 時(shí)，分別加入終濃度為0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6 mM 的IPTG，在25℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)，4 h 后經(jīng)10000 g 離心5 min收集菌體，使用無(wú)菌水重懸后按比例加入SDS 上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，12%SDS-PAGE 電泳分析重組蛋白的表達(dá)情況。

1.6.2 不同溫度對(duì)重組蛋白表達(dá)量及表達(dá)形式的影響取過(guò)夜培養(yǎng)的含重組質(zhì)粒的菌液，按1∶50稀釋到含卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37℃，180 rpm 振蕩培養(yǎng)至OD600在0.5 左右，加入上一步優(yōu)化確定的 IPTG 至終濃度，18℃、25℃、30℃、35℃下，180 rpm 繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后收集菌體，使用12%SDS-PAGE 電泳分析誘導(dǎo)溫度對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響。按照細(xì)菌蛋白抽提試劑盒說(shuō)明，對(duì)不同溫度下誘導(dǎo)的含重組蛋白的菌液進(jìn)行裂解，分別取上清和沉淀進(jìn)行12%SDS-PAGE 電泳，分析不同溫度下重組蛋白的表達(dá)形式。

1.7 PP2Ac 包涵體蛋白的純化

根據(jù)優(yōu)化的表達(dá)條件，選擇使用IPTG 濃度0.2 mM、溫度30℃的條件大量誘導(dǎo)表達(dá)PP2Ac，取誘導(dǎo)后的菌液及未經(jīng)誘導(dǎo)的菌液進(jìn)行12% SDSPAGE 電泳，使用電轉(zhuǎn)印法在100 V 電壓下轉(zhuǎn)印1 h至PVDF 膜(0.45μm)上，加入抗His 標(biāo)簽鼠單克隆抗體(1∶3500 稀釋)，4℃過(guò)夜，再加入Goat Anti-Mouse IgG HRP 抗體(1∶2000 稀釋)，取出膜后進(jìn)行DAB 顯色對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢驗(yàn)。

表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)4℃、12000 r/min 離心10 min 收集，按照Ni-Agarose His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行包涵體蛋白的純化，經(jīng)SDS-PAGE 檢測(cè)純化的重組蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的克隆

以菜蛾cDNA 為模板，對(duì)PP2Ac 基因進(jìn)行擴(kuò)增的產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示(圖1)有一條大小約為940 bp 的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 PCR 擴(kuò)增PP2Ac 基因Fig.1 PP2Ac gene amplified by PCR

2.2 菜蛾原核表達(dá)載體的構(gòu)建

小菜蛾P(guān)P2Ac 基因的PCR 產(chǎn)物與表達(dá)載體pET30a 的質(zhì)粒DNA，分別使用限制性?xún)?nèi)切酶HindⅢ與BamHⅠ雙酶切后進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化。經(jīng)藍(lán)白班篩選，挑取陽(yáng)性單克隆并進(jìn)行PCR 鑒定(圖2)，確定轉(zhuǎn)化成功后提取重組質(zhì)粒，使用Hind Ⅲ與BamHⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，得到5.4 Kb 的載體片段以及相應(yīng)大小為941bp 的目的片段(圖3)，說(shuō)明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功，命名為pET30a-PX-PP2Ac。

圖2 重組質(zhì)粒PCR 鑒定Fig.2 PCR verify the recombinant plasmid

圖3 Hind Ⅲ與BamHⅠ雙酶切鑒定Fig.3 Used restrict enzyme Hind Ⅲand BamH I to verify the recombinant plasmid

2.3 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

2.3.1 不同IPTG 濃度對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的影響

由SDS-PAGE 電泳結(jié)果顯示(圖4)，在全菌液中重組蛋白表達(dá)量隨著IPTG 濃度的提高而增加，但是非目的蛋白的表達(dá)量也有所增加，在使用終濃度為0.2 mM 的IPTG 誘導(dǎo)時(shí)，非目的蛋白存在較少同時(shí)可大量表達(dá)目的蛋白，因此確定該濃度為表達(dá)重組蛋白的最佳濃度。

圖4 25℃下不同IPTG 濃度下誘導(dǎo)pET30a-PX-PP2Ac 蛋白表達(dá)Fig.4 Different concentration of IPTG induced pET30a-PX-PP2Ac protein expression under 25°C

2.3.2 不同溫度對(duì)重組蛋白表達(dá)量及表達(dá)形式的影響

在菌液中加入終濃度為0.2 mM 的IPTG，以溫度為18、25、30、35℃的條件下對(duì)菌液進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，由圖5 可見(jiàn)，目的蛋白的表達(dá)量濃度隨著溫度的升高而增加。但是，圖6 顯示在不同溫度誘導(dǎo)的菌體的裂解液中，目的蛋白均以包涵體形式存在于沉淀中，菌體裂解液的上清中沒(méi)有可溶性蛋白。

圖5 0.2 mM IPTG 誘導(dǎo)，不同溫度下pET30a-PX-PP2Ac 的蛋白表達(dá)Fig.5 0.2 mM concentration of IPTG induced pET30a-PX-PP2Ac protein expression under different temperature

圖6 不同溫度下pET30a-PX-PP2Ac 重組蛋白的表達(dá)形式Fig.6 Existence form of the pET30a-PXPP2Ac protein expression under different temperature

2.4 重組蛋白的純化

經(jīng)Western Blot 對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)后可見(jiàn)(圖7)，誘導(dǎo)的菌液在35-40 KDa 間出現(xiàn)一條與目的蛋白大小相符的條帶，這說(shuō)明菌液中的蛋白與抗His 標(biāo)簽的抗體間具有良好的特異性反應(yīng)，而未經(jīng)誘導(dǎo)的菌液沒(méi)有條帶的產(chǎn)生，結(jié)果顯示誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物是具有His 標(biāo)簽的目的蛋白。

圖7 Western blot 分析PP2Ac 蛋白Fig.7 Western blot analysis of thePP2Ac protein

目的蛋白經(jīng)純化后，通過(guò)12%SDS-PAGE 檢測(cè)，結(jié)果顯示(圖8)，使用300 mM 咪唑洗脫液對(duì)結(jié)合了目的蛋白的鎳柱進(jìn)行洗脫，在第2、3 mL洗脫液中出現(xiàn)了大小約38 KD 目的蛋白，由于目的蛋白周?chē)鸁o(wú)雜帶，可以將其分離后進(jìn)行后續(xù)的相關(guān)研究使用。

圖8 pET30a-PX-PP2Ac 表達(dá)蛋白的純化Fig.8 Purify the pET30a-PX-PP2Ac protein of expression

3 結(jié)論與討論

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是基因工程中常用的表達(dá)工具，但是在表達(dá)外源基因的過(guò)程當(dāng)中，常會(huì)遇到表達(dá)效率不高、產(chǎn)率較低、蛋白表達(dá)無(wú)活性等問(wèn)題。誘導(dǎo)條件的改變對(duì)于目的蛋白的表達(dá)具有一定的影響。有報(bào)道稱(chēng)，較低濃度的IPTG 即可誘導(dǎo)外源蛋白的大量表達(dá)(張嘉萱等，2011)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示IPTG 濃度為0.2 mM 時(shí)即可誘導(dǎo)pET30a-PX-PP2Ac 的大量表達(dá)，隨著IPTG 濃度的增加，重組蛋白的表達(dá)量并無(wú)明顯提高，但非目的蛋白的表達(dá)量有所增加，所以選用終濃度為0.2 mM 的IPTG 誘導(dǎo)該蛋白的表達(dá)。降低誘導(dǎo)溫度可以增加重組蛋白的可溶性表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物的活性，使包涵體的比例下降(宛傳丹等，2004;李琳，2010)。在本試驗(yàn)中分別在18、25、30、35℃對(duì)重組蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，將菌體裂解后分析蛋白的表達(dá)形式，結(jié)果表明重組蛋白均存在于沉淀中，以包涵體的形式存在，由此可見(jiàn)菜蛾P(guān)P2Ac 在原核表達(dá)中受誘導(dǎo)條件改變的影響不大，較難產(chǎn)生可溶性蛋白。為了解決這一問(wèn)題，可考慮選用其他表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)目的蛋白進(jìn)行表達(dá)(吳丹等，2002)。

目前，斑蝥素作為殺蟲(chóng)劑已經(jīng)開(kāi)發(fā)應(yīng)用(張雅林等，2006)，并且在我國(guó)已被作為農(nóng)藥產(chǎn)品投放市場(chǎng)，也明確了斑蝥素與有關(guān)殺蟲(chóng)劑混用的增效作用(刁紹東等，2003;魏列新等，2007;鄭勝禮等，2007)。但是，斑蝥素對(duì)昆蟲(chóng)的毒殺機(jī)理及作用機(jī)制尚不完全明確。本試驗(yàn)選取IPTG 終濃度0.2 mM、溫度30℃為表達(dá)條件大量表達(dá)目的蛋白后，經(jīng)純化后得到了可分離的包涵體蛋白。此蛋白的獲得為研究PP2A 蛋白結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)，一方面有利于明確斑蝥素與PP2Ac 間的結(jié)合作用，豐富對(duì)斑蝥素殺蟲(chóng)作用機(jī)理的了解;另一方面，可從菜蛾P(guān)P2A 的蛋白結(jié)構(gòu)入手，比較昆蟲(chóng)與哺乳動(dòng)物間的差異，并以此為基礎(chǔ)對(duì)斑蝥素及其類(lèi)似物農(nóng)藥在化學(xué)結(jié)構(gòu)上進(jìn)行修飾，從而提高對(duì)靶標(biāo)生物的藥效。同時(shí)，利用純化的蛋白作為抗原制備單克隆抗體對(duì)昆蟲(chóng)體內(nèi)的PP2A 蛋白分布進(jìn)行免疫檢測(cè)，可以掌握受體蛋白在蟲(chóng)體的分布，對(duì)斑蝥素類(lèi)農(nóng)藥的劑型改良及施用方式等具有一定的指導(dǎo)意義。此外，還可將單抗固定在惰性固相基質(zhì)上制成層析柱(王莉等，2007)，使PP2A 蛋白質(zhì)與單抗特異性結(jié)合，對(duì)PP2A 蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化，從而高效、大量的獲得目的蛋白，為進(jìn)一步明確斑蝥素及其類(lèi)似物在殺蟲(chóng)過(guò)程中與靶標(biāo)受體PP2A 的作用過(guò)程提供基礎(chǔ)。

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