李帥鵬+黃顯會+王偉+嚴常燕+孔祥凱??

摘 要 建立了高效液相色譜 串聯(lián)質譜法同時測定牛、羊組織中硝碘酚腈、氯羥柳胺、氯氰碘柳胺、碘醚柳胺4種苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥的多殘留檢測方法。樣品用乙腈 丙酮（60∶40，V/V）（肌肉、肝臟和腎臟組織）或1%三乙胺乙腈（脂肪組織）超聲提取，MAX陰離子固相萃取柱凈化，液相色譜分離，采用多反應監(jiān)測負離子模式對4種藥物同時進行定性定量分析，在1～100 μg/L 范圍內(nèi)，4種藥物與其對應峰面積的線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.99。在牛、羊組織中的檢出限（LOD）均為1 μg/kg，定量限（LOQ）均為2.5 μg/kg。 在LOQ、0.5倍最高殘留限量（MRL）、MRL、2倍MRL添加水平下，4 種藥物的平均回收率在71%～112%之間，日內(nèi)相對標準偏差（RSD）在1.1%～14.0%之間，日間RSD在6.4%～14.7%之間。采用本方法對市場上動物可食性組織進行抽樣檢測，共抽檢40份樣品，2份樣品檢測出苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥殘留。

關鍵詞 苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥； 牛羊組織； 多殘留； 高效液相色譜 串聯(lián)質譜

1 引 言

氯羥柳胺（OXY）、硝碘酚腈（NIT）、氯氰碘柳胺（CLO）、碘醚柳胺（RAF）是一類苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥，作用機理是通過阻斷肝片吸蟲的氧化磷酸化過程，使蟲體麻痹、死亡，用于驅殺牛、羊的肝片吸蟲、蛔蟲和絳蟲，對血毛線蟲、巨片吸蟲和羊蠅蛆亦有較好作用。隨著國內(nèi)驅蟲藥的廣泛應用和研究，發(fā)現(xiàn)碘醚柳胺有明顯胚胎毒性[1]； 氯氰碘柳胺對肝、腎具有一定的毒、副作用[2]； 高劑量硝碘酚腈可引起心臟、神經(jīng)、肌肉和呼吸的損害[3]。歐洲醫(yī)藥評價署、澳大利亞以及食品法典委員會均已制定了上述藥物的最大殘留限量（Maximum residue limit，MRL），殘留標志物均為原形藥物，殘留監(jiān)測的動物是牛羊。靶組織MRL分別如下：硝碘酚腈：牛、羊，肌肉400 μg/kg、脂肪200 μg/kg、肝20 μg/kg、腎400 μg/kg。碘醚柳胺：牛，肌肉30 μg/kg、脂肪30 μg/kg、肝10 μg/kg、腎40 μg/kg； 羊，肌肉100 μg/kg、脂肪250 μg/kg、肝150 μg/kg、腎150 μg/kg。氯氰碘柳胺：牛，肌肉1000 μg/kg、脂肪3000 μg/kg、肝1000 μg/kg、腎3000 μg/kg； 羊，肌肉1500 μg/kg、脂肪2000 μg/kg、肝1500 μg/kg、腎5000 μg/kg。氯羥柳胺：牛、綿羊，肌肉20 μg/kg、脂肪20 μg/kg、肝500 μg/kg、腎100 μg/kg。我國農(nóng)業(yè)部（2003）235號公告[4]已經(jīng)頒布硝碘酚腈、碘醚柳胺、氯氰碘柳胺的最高殘留限量，氯羥柳胺的最高殘留限量正在制定中。

目前，關于苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥在組織中殘留的檢測方法主要有高效液相色譜與紫外檢測器[5～8]、熒光檢測器和質譜檢測器聯(lián)用[9，10]、高效液相色譜 串聯(lián)質譜法[11～16]。國內(nèi)僅報道高效液相色譜 串聯(lián)質譜法[9]檢測氯氰碘柳胺在牛組織和牛奶中殘留的研究，國外對于苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥在組織中殘留分析方法的報道主要局限于某種組織或者是單殘留和兩種藥物的殘留檢測方法，尚未報道關于4種苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥在牛、羊組織中的多殘留檢測方法。本研究采用HPLC MS/MS分析牛、羊組織中4種苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥的多殘留，方法前處理簡便易行，靈敏度高，精密度及重復性好，適用于牛、羊組織中苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥的多殘留檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Agilent 1200型液相色譜儀（美國安捷倫公司）； API4000電噴霧 串聯(lián)四極桿質譜儀，配Analyst 4.1.5 軟件（美國應用生物系統(tǒng)公司）； C18 色譜柱（150 mm×2.1 mm， 3.5 μm， 美國Waters公司）； Centrifuge5804臺式高速離心機（美國Eppendorf公司）； D10 24型氮氣濃縮儀（杭州奧盛儀器有限公司）； Milli Q純水機（美國Millipore公司）； CNWBOND MAX固相萃取小柱（60 mg/3 mL，德國CNW科技公司）。

硝碘酚腈（Nitroxinil，NIT）精制對照品（純度98.5%，批號 091205），氯羥柳胺（Oxyclozanide，OXY）精制對照品（純度98.5%，批號1670811），氯氰碘柳胺鈉（Closantel，CLO）精制對照品（純度94.1%，批號 67111001），碘醚柳胺（Rafoxanide，RAF）精制對照品（純度99.5%， 批號 0505028），均購自河北遠征藥業(yè)有限公司； 乙腈、甲醇、甲酸（色譜純，德國CNW科技公司）； 乙酸銨（色譜純，美國TEDIA公司）； 氨水、冰醋酸（分析純，江蘇強盛功能化學股份有限公司）； 實驗用水為超純水。

2.2 溶液的配制

標準儲備液：準確稱取適量的硝碘酚腈、氯羥柳胺、氯氰碘柳胺、碘醚柳胺對照品，用乙腈分別配制成1 g/L的單一標準儲備液及100 μg/mL的混合標準溶液。1%三乙胺 乙腈溶液：取1.0 mL三乙胺，用乙腈定容至100 mL，混勻。25% 氨化乙腈溶液：取25.0 mL氨水，用乙腈定容至100 mL，混勻。5%甲酸 乙腈溶液；0.1%甲酸溶液。

2.3 色譜 質譜條件

2.3.1 色譜條件 C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）； 流速： 0.25 mL/min； 柱溫： 35 ℃； 進樣量： 5 μL； 流動相： 甲醇（A）， 乙腈（B）， 0.1%甲酸溶液（C）。梯度洗脫程序： 0.0 min， 15%A， 25%B； 0.0～1.0 min， 15%～30%A， 25%～70%B； 1.0～6.0 min， 30%A， 70%B； 6.0～6.5 min， 30%～15%A， 70%～25%B； 6.5～13.0 min， 15%A， 25%B。

2.3.2 質譜條件 用多反應監(jiān)測（MRM）掃描模式； 電噴霧離子源（ESI）； 負離子掃描； 電噴霧電壓

Symbolm@@ 3500 V， 離子源溫度 650 ℃，氣簾氣壓力15 kPa，霧化氣壓力60 kPa，輔助氣壓力 60 kPa。射入電壓、碰撞能量、去簇電壓、碰撞室射出電壓及定性離子對、定量離子對等參數(shù)見表1。

2.4 樣品的處理與凈化

（1）肌肉、肝臟、腎臟組織樣品 已勻漿組織樣品在室溫下自然解凍，準確稱取（2.00±0.02）g，置于50 mL離心管中， 加入乙腈 丙酮混合液（60∶40，V/V）15 mL，漩渦混懸15 s，超聲提取10 min，300 r/min振搖10 min，8000 r/min 離心10 min后收集上清液； 上清液中加入1 mL 5%氨水待凈化。（2）脂肪組織樣品 已勻漿組織樣品在室溫下自然解凍，準確稱?。?.00±0.02）g，置于50 mL離心管中，加入1%三乙胺 乙腈溶液15 mL，漩渦混懸15 s，超聲提取10 min，300 r/min振搖10 min，8000 r/min 離心10 min后收集上清液； 上清液中加入2 mL 5%氨水后， 置于

Symbolm@@ 20 ℃冷藏1 h，取出后在4 ℃下8000 r/min離心10 min。上清液轉移至另一個50 mL離心管中，待凈化。

MAX固相萃取柱預先用25%氨化 乙腈溶液3 mL活化，再將前述上清液裝載入柱，以1.0 mL/min流速過柱。待上清液流出后，依次用3 mL水和3 mL甲醇分別淋洗，負壓抽干后用5%甲酸 乙腈溶液3 mL洗脫，收集洗脫液，在40 ℃下氮氣吹干，殘渣用0.5 mL流動相溶解，轉移至2 mL離心管，加入乙腈飽和的正己烷0.5 mL，渦旋，于4 ℃下15000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm濾膜，待測。

3 結果與討論

3.1 質譜參數(shù)的確定

用針泵連續(xù)直接進樣（單一標準溶液1 mg/L），發(fā)現(xiàn)ESI

準分子離子峰。優(yōu)化各質譜參數(shù)，進行相應的子離子全掃描，以確定MRM特征診斷離子。根據(jù)歐盟 2002/657/EC[20]制定的分析方法確認的標準和程序規(guī)定，各藥物的母離子、子離子及部分質譜參數(shù)見表1。

3. 2 色譜條件的優(yōu)化

3.2.1 色譜柱的選擇 由于硝碘酚腈、氯羥柳胺、氯氰碘柳胺、碘醚柳胺的脂溶性較高、極性小，所選色譜柱的固定相應為直鏈烷烴鍵合的硅膠，其中最常見的為十八烷基鍵合硅膠（即C18）。本研究考察了菲羅門Gemini C18（150 mm×2.0 mm， 5 μm）、CNW C18（250 mm×4.6 mm，5

和Waters C18 （150 mm×2.1 mm，3.5 μm）填料的色譜柱。氯氰碘柳胺和碘醚柳胺在Gemini C18色譜柱上峰形較寬，在樣品檢測時基質雜音較大； 在CNW C18色譜柱上，由于氯氰碘柳胺和碘醚柳胺極性較弱，當加大乙腈的比例后，這兩者的分離效果不理想，而且純標液的基線在后， 兩種藥物出峰之前容易漂移； Waters C18色譜柱對4種藥物有良好的保留性質，各待測藥物均可得到優(yōu)異的峰型。因此采用Waters C18 色譜柱。

3.2.2 流動相的選擇 比較了甲醇或乙腈（有機相）與乙酸銨緩沖溶液、甲酸水溶液、超純水（水相）組合對峰型、靈敏度及分辨率的影響。研究表明， 選擇甲醇或乙腈作為有機相， 均可對4種藥物進行有效的分離，但是在甲醇為流動相時，硝碘酚腈的出峰時間在10.26 min，以乙腈為流動相時，硝碘酚腈的出峰時間在3.72 min。為了縮短藥物的出峰時間和優(yōu)化4種藥物的峰形，選擇乙腈和甲醇作為流動相?？疾炝思状蓟蛞译妫ㄓ袡C相）與5 mmol/L乙酸銨、10 mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸溶液在不同梯度條件下對藥物峰的影響，發(fā)現(xiàn)乙酸銨的加入，未能改善氯氰碘柳胺和碘醚柳胺的峰形， 峰形較寬，基質雜音較大。當選擇乙腈和0.1%甲酸溶液時，需要加大有機相的比例才能對將氯氰碘柳胺和碘醚柳胺洗脫。當選擇0.1%甲酸 乙腈 甲醇作為流動相時，采用2.3.1節(jié)所示方法進行梯度洗脫，4種藥物均可得到良好的峰型。

3.3 樣品前處理方法的研究

根據(jù)4種藥物的理化性質以及文獻＼[12，18，19]，考察了乙腈、1%三乙胺乙腈和1%醋酸丙酮、乙腈 丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇等的提取效果。發(fā)現(xiàn)甲醇、三氯甲烷、乙酸乙酯不能有效地提取這4種藥物，回收率在40%～70%； 用乙腈或1%三乙胺乙腈時，提取回收率均能達到80%以上； 用1%醋酸丙酮提取后，加入5 mL氨水，出現(xiàn)較多雜質，且回收率不穩(wěn)定（60%～75%）； 乙腈 丙酮混合液提取時，回收率均能達到80%以上，且乙腈 丙酮（60∶40，V/V）回收率偏高于乙腈 丙酮（80∶20，V/V）。乙腈具有較強的除蛋白和脫脂作用，對脂肪溶解性差，經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn)1%三乙胺乙腈作為脂肪組織的提取劑回收率較好，乙腈 丙酮（60∶40，V/V）對肌肉、肝臟、腎臟均有較好的提取效果。由于4種藥物為弱酸性藥物，且乙腈和丙酮的極性較強，過柱后， 硝碘酚腈的回收率在65%～70%，5%氨水溶液為堿性環(huán)境，通過加入5%氨水可以使4種藥物給出質子，呈陰離子態(tài)，有利于其在陰離子交換柱上被保留。實驗過程中，對比加入1、2和4 mL 5%氨水溶液，發(fā)現(xiàn)在肌肉、肝臟、腎臟提取液中加入1 mL 5%氨水溶液，在脂肪提取液中加入2 mL 5%氨水溶液，4種藥物的回收率在80%～110%之間。

凈化過程中，根據(jù)苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥的理化性質，直接比較了菲羅門 Strata X 柱、MAX柱的凈化效果，發(fā)現(xiàn)硝碘酚腈和碘醚柳胺有很好的保留，回收率均在80%以上，而氯羥柳胺和氯氰碘柳胺在Strata X柱上的回收率較差，分別約為55%和32%。因此選用MAX小柱，對比了CNW MAX（60 mg/3 mL）、CNW MAX（500 mg/6 mL）及Waters MAX（60 mg/3 mL）3種小柱的凈化效果。發(fā)現(xiàn)4種藥物在CNW MAX柱的回收率均在80%。 考慮實驗成本，最終選擇CNW MAX（60 mg/3 mL）小柱。

圖1和圖2為4種苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥標準溶液和樣品的MRM色譜圖。4種藥物依次是硝碘酚腈、氯羥柳胺、氯氰碘柳胺、碘醚柳胺，保留時間依次為6.29， 7.03， 8.22和8.47 min。

3.4 基質效應

樣品基質溶液對目標物的電噴霧離子化有很大影響，可增強或抑制信號響應，進而影響測定結果的準確度與精密度。本實驗在空白組織基質提取液中添加不同濃度的苯酚類和水楊酸苯胺類藥物混合標準溶液，與相應流動相（純?nèi)軇┲械男盘枏姸龋ǚ迕娣e）相比較，發(fā)現(xiàn) 4 種苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥在組織中的響應值均低于純?nèi)軇榱私档突|效應，采用MAX固相萃取柱對樣品進行凈化，使離子抑制效應明顯降低。其次，優(yōu)化色譜分離條件，分離內(nèi)源性物質。由于基質效應主要出現(xiàn)在出峰較早的時間段，所以使用梯度洗脫方法調節(jié)分析物與內(nèi)源性物質的出峰時間，使二者分離。此外，本研究采用基質匹配標準法定量分析，消除基質效應。

3.5 線性范圍與檢出限

為減少或消除基質效應的影響，采用空白基質匹配標準溶液法獲得組織樣品的標準曲線。準確稱取2 g組織于50 mL 離心管中，按照2.4節(jié)方法處理，在空白樣品經(jīng)提取凈化吹干后的殘余物中添加標準工作液，得1， 2， 5， 10， 50和100 μg/L的基質加標溶液，用 HPLC MS/MS 分析，每個濃度平行測定5次。超出100 μg/L的基質匹配標準溶液用空白樣品基質提取液稀釋至1～100 μg/L范圍內(nèi)，進行LC MS/MS測定，用于單點法校準。按所得峰面積平均值對相應濃度作標準曲線，以峰面積（y）對其質量濃度（x，μg/L）作圖，求得回歸方程和相關系數(shù)。采用空白組織添加低濃度標準溶液，按2.4節(jié)方法進行處理后檢測，以信噪比S/N≥3確定檢出限（LOD），以S/N≥10 確定定量限（LOQ）。

結果表明，4種苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥在1～100 μg/L 范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)在0.9901～0.9999之間，檢出限均為1 μg/kg，定量限均為2.5 μg/kg，滿足殘留檢測的要求。

3.6 準確度與精密度

采用相應基質標準溶液單點校正法計算回收率，按照LOQ， 0.5 MRL， MRL， 2MRL作為添加濃度，每個添加水平平行5份同日測定，連續(xù)測定5日，結果表明，4 種苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥的平均回收率為71%～112% ，日內(nèi)RSD為1.1%～14.0%，日間RSD為6.4%～14.7%（表2），說明方法的重復性好，通用性強，可滿足牛羊組織中4種苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥殘留檢測的要求。

3.7 抽樣檢測

從市場購買牛、羊的脂肪、肌肉各100 g，整個腎臟，整個肝臟。每種動物每種組織樣品各取5份，共抽檢40份樣品，每份樣品平行2個樣，按本方法進行制樣和檢測。結果表明，1份羊腎臟檢測出13 μg/kg硝碘酚腈殘留，1份牛肝臟檢測出45 μg/kg氯氰碘柳胺殘留，其余樣品未檢測出苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥殘留。綜上可知，本方法可檢測牛、羊肌肉、脂肪、肝臟和腎臟組織中苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥的殘留量，適用于檢測動物可食性組織中苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥的殘留。

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