馬立娜+劉殿駿+王振新

摘 要 發(fā)展了一種基于汞離子（Hg2+）適配體（Aptamer）免標(biāo)記金納米粒子的動(dòng)態(tài)光散射（DLS）法，用于靈敏、選擇性的檢測(cè)溶液中的Hg2+。Aptamer 5′ TTTCTTCTTTCTTCCCCCCTTGTTTGTTGTTT 3′與Hg2+的特異性結(jié)合使金納米粒子失去保護(hù)，在含有100 mmol/L NaCl的緩沖溶液中發(fā)生聚集，金納米粒子的平均水合粒徑變大。在pH=7.43，110 nmol/L Aptamer ，100 mmol/L NaCl，Hg2+與Probe DNA孵育時(shí)間為30 min的實(shí)驗(yàn)條件下，金納米粒子水合粒徑的變化值（

SymbolDA@ D）與Hg2+的濃度成正比。檢出Hg2+的線性范圍為0.1 nmol/L～5 μmol/L，檢出限達(dá)0.1 nmol/L。湖水及礦泉水兩種水樣加標(biāo)實(shí)驗(yàn)表明本方法能夠用于實(shí)際水樣中Hg2+的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 汞離子； 動(dòng)態(tài)光散射（DLS）； 汞離子適配體（Aptamer）； 金納米粒子

1 引 言

作為全球性環(huán)境污染物，汞具有致畸、致癌作用，是蓄積性毒物，對(duì)人體健康危害嚴(yán)重[1]。常用的汞檢測(cè)方法有冷原子吸收光譜法（CAAS）[2]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP MS）[3]、冷原子熒光光譜法（CAFS）[4]等，這些方法的優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確度比較高，缺點(diǎn)是均依賴大型儀器，成本比較高，需要熟練的操作人員，預(yù)處理過(guò)程繁瑣耗時(shí)，不能滿足環(huán)境監(jiān)測(cè)中高效低成本的需要。

近年研究發(fā)現(xiàn)，Hg2+能介導(dǎo)胸腺嘧啶（T）配對(duì)，形成穩(wěn)定的T Hg2+ T特異性結(jié)構(gòu)[5]。金納米粒子（GNPs）具有較高的摩爾消光系數(shù)，大的比表面積，與粒子形狀、大小、聚集程度以及粒子之間距離相關(guān)的光學(xué)性質(zhì)等特點(diǎn)[6]，可設(shè)計(jì)一系列生化反應(yīng)以改變GNPs間的距離，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)?？蓪NPs的光學(xué)特性和T Hg2+ T特異性結(jié)構(gòu)相結(jié)合用于檢測(cè)Hg2+＼[7，8]，該類方法的特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單。

動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)（Dynamic light scattering， DLS），是指通過(guò)測(cè)量樣品散射光強(qiáng)度變化得出樣品顆粒大小信息的一種技術(shù)。這種方法測(cè)量過(guò)程不干擾樣品本身的性質(zhì)，能夠反映出溶液中樣品分子的真實(shí)狀態(tài)，測(cè)量過(guò)程迅速，檢測(cè)靈敏度高，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)樣品的動(dòng)態(tài)變化。目前，這種方法已經(jīng)被應(yīng)用于檢測(cè)金屬離子[9，10]和癌癥標(biāo)記物[11]等。本研究結(jié)合GNPs的光學(xué)特性和T Hg2+ T特異性結(jié)構(gòu)，運(yùn)用DLS的方法檢測(cè)溶液中的Hg2+，比文獻(xiàn)＼[7]靈敏度提高了3個(gè)數(shù)量級(jí)，且方法具有較好的選擇性。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Zetasizer Nano ZS 90動(dòng)態(tài)光散射粒度儀（DLS，英國(guó)Malvern公司）用于測(cè)量粒子的水合粒徑，實(shí)驗(yàn)操作條件為：溫度25 ℃，散射角度90°，激光器波長(zhǎng)633 nm； Mini 1240型紫外 可見分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）； iCAP 6300型電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀（ICP AES， 美國(guó)Thermo公司）； H600型透射電子顯微鏡（TEM，日本Hitachi公司）。氯金酸（HAuCl4·3H2O，Sigma Aldrich公司）。DNA（上海生工生物工程有限公司），Hg2+ aptamer（Probe DNA）序列如下：5′ TTTCTTCTTTCTTCCCCCCTTGTTTGTTGTTT 3′，對(duì)照DNA（Control DNA）序列如下：5′ AAACGGCAAAACATCCCCCCAAGTAAGAAGAAA 3′[12]，DNA的濃度由260 nm處測(cè)得的紫外吸光度確定，其消光系數(shù)等于鏈中所含各堿基的摩爾消光系數(shù)之和。4 羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPEs，北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司），乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA），NaCl，NaOH，Al2（SO4）3·18H2O，MgCl2·6H2O，CaCl2，BaCl2·2H2O，ZnCl2，CuSO4·5H2O，CoCl2·6H2O，3CdSO4·8H2O，F(xiàn)e2（SO4）3，Pb（CH3COO）2，Hg（NO3）2·H2O及其它實(shí)驗(yàn)用試劑均為分析純?cè)噭?，?gòu)于北京化工廠。實(shí)驗(yàn)用水為Milli Q （18.2 MΩ cm）超純水。

2.2 金納米粒子的制備

按照Frens Turkevich方法[13，14]合成金納米粒子。取100 mL 超純水置于250 mL三頸瓶中，冷凝回流及磁力攪拌下油浴加熱至沸騰；取1% 氯金酸溶液2 mL加入到三頸瓶中，溶液變?yōu)闇\黃色。在氯金酸的沸騰溶液中，迅速加入1% 檸檬酸鈉溶液8 mL，溶液顏色先變?yōu)樯n白色，隨后變?yōu)樗{(lán)色，最后變?yōu)樯罴t色。繼續(xù)攪拌加熱30 min，緩慢冷卻至室溫，置于細(xì)口瓶中備用。

2.3 金屬離子檢測(cè)

將4 μL 10 μmol/L Probe DNA先與180 μL含有不同濃度Hg2+的HEPEs緩沖溶液（100 mmol/L，pH 7.43）反應(yīng)30 min，加入200 μL GNPs繼續(xù)反應(yīng)10 min后，加入適量NaCl溶液，使溶液的總體積為400 μL， NaCl最終濃度為100 mmol/L。加入NaCl 3 min后測(cè)GNPs水合粒徑。以相同濃度的Control DNA與Hg2+作用為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次。

2.4 EDTA恢復(fù)實(shí)驗(yàn)

將4 μL 10 μmol/L Probe DNA與180 μL 500 nmol/L Hg2+反應(yīng)30 min，再加入不同濃度的EDTA及3 μL 1 mmol/L NaOH溶液反應(yīng)30 min，繼續(xù)加入200 μL GNPs反應(yīng)10 min后，加入適量NaCl溶液，使NaCl的最終濃度為100 mmol/L，溶液的總體積為400 μL。加入NaCl 3 min后測(cè)GNPs水合粒徑。

3 結(jié)果與討論

3.1 金納米粒子的表征

紫外可見吸收光譜法測(cè)得所合成的GNPs的最大吸收峰為520 nm，GNPs粒徑的TEM表征結(jié)果為（14.0±1.5） nm，DLS表征結(jié)果為（24.2±0.5） nm。因?yàn)镈LS測(cè)得的是GNPs的水合粒徑，TEM則直接測(cè)得金核的大小，所以DLS的表征結(jié)果高于TEM的表征結(jié)果[15]。

3.2 檢測(cè)原理

Fig.1 Schematic representation of label free gold nanoparticles （GNP） based dynamic light scattering （DLS） assay for Hg2+ detection并且取決于Probe DNA的構(gòu)象和方位性。由于GNPs的靜電吸引力，Probe DNA發(fā)生瞬間結(jié)構(gòu)變化，堿基朝著GNPs，不可逆的吸附在GNPs上。因Probe DNA分子間的靜電排斥作用，在較高離子強(qiáng)度時(shí)，GNPs依然能夠保持單分散狀態(tài)，此時(shí)測(cè)得的GNPs水合粒徑以D0表示。當(dāng)溶液中存在Hg2+時(shí)，由于Hg2+和Probe DNA介導(dǎo)配對(duì)形成T Hg2+ T特異性結(jié)構(gòu)的能力大于Probe DNA與GNPs之間的作用力，從而導(dǎo)致Probe DNA自身彎折形成雙鏈結(jié)構(gòu)，從GNPs表面脫離，在較高離子強(qiáng)度下，無(wú)保護(hù)的GNPs易發(fā)生團(tuán)聚，使GNPs的水合粒徑變大[16，17]，此時(shí)測(cè)得的GNPs水合粒徑以D表示。Hg2+ aptamer與Hg2+間特定專一的相互作用，使得本方法具有良好的選擇性。

3.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，考察了溶液pH值，Probe DNA濃度，NaCl濃度以及Hg2+與Probe DNA孵育時(shí)間對(duì)Hg2+檢測(cè)結(jié)果的影響。以GNPs水合粒徑的

SymbolDA@ D值（

SymbolDA@ D=D-D0）作為考察體系聚集程度的標(biāo)準(zhǔn)。如圖2所示，在pH 7.43，Probe DNA濃度為110 nmol/L，NaCl濃度為100 mmol/L，Hg2+與Probe DNA孵育時(shí)間為30 min時(shí)，

SymbolDA@ D值最大。以后的Hg2+檢測(cè)實(shí)驗(yàn)均在此優(yōu)化條件下進(jìn)行。

圖2 （a）不同pH值，（b）不同Probe DNA濃度，（c）不同NaCl濃度，和（d）不同的Hg2+與Probe DNA孵育時(shí)間對(duì)

SymbolDA@ D的影響

SymbolDA@ D與Hg2+濃度關(guān)系曲線，插圖為Hg2+濃度校正曲線

Fig.3 Plot of

SymbolDA@ Dand concentration of Hg2+. The inset is the calibration curve for Hg2+

3.4 Hg2+的測(cè)定

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)Hg2+進(jìn)行了檢測(cè)，如圖3所示。隨著Hg2+的濃度變大，

SymbolDA@ D值逐漸增大。以Hg2+濃度的對(duì)數(shù)與

SymbolDA@ D作圖，得到Hg2+濃度校正曲線。線性范圍為0.1 nmol/L～5 μmol/L，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.99。方法的檢出限0.1 nmol/L（3S，S為對(duì)照實(shí)驗(yàn)經(jīng)20次測(cè)量得到的標(biāo)準(zhǔn)偏差）[18]遠(yuǎn)低于世界衛(wèi)生組織（WHO）和美國(guó)環(huán)境保護(hù)局（EPA）規(guī)定的飲用水中Hg2+含量標(biāo)準(zhǔn)2.0 μg/L（10 nmol/L）及6.0 μg/L（30 nmol/L）[19，20]，說(shuō)明本方法滿足對(duì)實(shí)際水樣中Hg2+的檢測(cè)要求。

圖4為在不同濃度的Hg2+存在下GNPs的TEM圖。溶液中不存在Hg2+時(shí)， GNPs呈單分散狀態(tài)（圖4a）； 1 nmol/L Hg2+存在時(shí)， 有明顯的聚集體形成（圖4b）； 隨著Hg2+濃度增大， GNPs聚集程度逐漸增加（圖4c，4d）。 TEM表征結(jié)果證明Hg2+的存在引起了GNPs聚集。這與DLS的表征結(jié)果一致。

圖4 （a） 0，（b） 1，（c） 10，和（d） 100 nmol/L Hg2+存在下GNPs的TEM表征圖

Fig.4 TEM micrographs of GNPs in the presence of （a） 0， （b） 1， （c） 10， and （d） 100 nmol/L Hg2+， respectively

3.5 EDTA恢復(fù)實(shí)驗(yàn)

向溶液中依次加入EDTA和NaOH，如圖5所示，

SymbolDA@ D值顯著降低。這是因?yàn)樵趬A性條件下，EDTA作為強(qiáng)的金屬離子螯合劑，能夠與Hg2+配位形成更加穩(wěn)定的配合物，破壞了T Hg2+ T特異結(jié)構(gòu)，從而使Probe DNA恢復(fù)自由狀態(tài)并與GNPs作用，使GNPs在較高離子強(qiáng)度下保持單分散狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，由于Hg2+與其適配體的特異性結(jié)合而使GNPs失去Probe DNA的保護(hù)，在較高離子強(qiáng)度下發(fā)生聚集，GNPs水合粒徑變大。

3.6 方法選擇性的考察

3.7 實(shí)際水樣中Hg2+的檢測(cè)

為了證明本方法的實(shí)用性，使用本方法對(duì)某湖水和礦泉水兩種水樣進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)。使用0.22 μm濾膜處理湖水樣品。結(jié)果如表1所示，檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP AES）所測(cè)數(shù)據(jù)有很好的一致性，證明本方法能應(yīng)用于實(shí)際水樣中Hg2+的檢測(cè)。本方法具有簡(jiǎn)單、選擇性好、靈敏度高和較寬線性范圍等優(yōu)點(diǎn)。

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