曾 霖 , 雷霽霖 , 劉 濱 , 洪萬樹 , 艾春香

(1.廈門大學 海洋與地球?qū)W院, 福建 廈門 361021; 2.中國水產(chǎn)科學研究院 黃海水產(chǎn)研究所, 山東 青島266071)

魚類對環(huán)境鹽度變化的適應(yīng)主要通過調(diào)節(jié)滲透壓相關(guān)的酶和轉(zhuǎn)運體蛋白的生物合成和功能發(fā)揮來實現(xiàn)的, 這些過程均需要消耗大量的能量[1], 能量主要由糖類、脂類、蛋白質(zhì)等三大營養(yǎng)物質(zhì)通過機體新陳代謝提供。研究表明, 鹽度變化會影響魚類機體的氨基酸和脂肪酸組成和含量。高滲透脅迫可以改變紅點鮭(Salvelinus alpinus)和金頭鯛(Sparus auratus)機體內(nèi)非必需脂肪酸(NEFA)總量[2-4]; 攀鱸(Anabas testudineus)在鹽度30水體中馴化6 h后, 其肌肉中天冬氨酸和丙氨酸含量顯著升高[5]; 經(jīng)過5 d的海水馴化后, 虹鱒(Oncorhynchus mykiss)肌肉中亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸等 3種支鏈氨基酸總量顯著增加[6]; 烏鱧(Channa argus)肌肉中氨基酸總量和呈味氨基酸總量隨鹽度的上升而增加[7]; 鹽度也可以改變魚類肌肉中高度不飽和脂肪酸的總量[8]; 鱸魚(Lateohtbrax japonicus)稚魚肌肉中多不飽和脂肪酸總量尤其是EPA和DHA總量隨鹽度的降低而增加,而對飽和脂肪酸總量影響不顯著[9]。此外, 有些氨基酸在魚類滲透壓調(diào)節(jié)過程中可以充當“細胞溶質(zhì)”,如紅點鮭、比目魚(Platichthys flesusL.)、羅非魚(Oreochromis mossambicus)等機體內(nèi)的牛磺酸、甘氨酸可以被動員起來參與滲透節(jié)調(diào)節(jié)[4,10-11]。

大菱鲆(Scophthal musmaximus)作為海水工廠化養(yǎng)殖以及向內(nèi)陸地區(qū)推廣的一種優(yōu)質(zhì)魚類日益受到人們的關(guān)注。目前, 中國大菱鲆工廠化養(yǎng)殖主要以北方為主, 大多采用地下井水, 也有采用地下井水和自然海水調(diào)配使用。地下井水水溫穩(wěn)定, 這使得大菱鲆能夠順利渡過夏季和冬季的不利環(huán)境, 特別是冬季可以大大降低越冬成本。然而, 不同井間的海水鹽度存在較大差異[12]。此外, 為了擴大大菱鲆的養(yǎng)殖范圍, 使之由沿海向半咸水域延伸。不同區(qū)域間海水鹽度也存在明顯差異。鹽度作為影響魚類肌肉品質(zhì)的重要環(huán)境因子, 目前的研究主要集中在鹽度變化對魚類肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分如粗脂肪、粗蛋白、水分等的影響, 而有關(guān)鹽度對魚類肌肉中氨基酸和脂肪酸組成和含量影響的研究較少。迄今, 有關(guān)鹽度對大菱鲆肌肉品質(zhì)的影響尚未見報道。本實驗將大菱鲆幼魚分別飼養(yǎng)在鹽度為 12、18、24、30和 36等 5種水體中, 以探討鹽度對大菱鲆幼魚肌肉中氨基酸和脂肪酸組成和含量的影響, 為揭示魚類滲透壓調(diào)節(jié)的能量代謝機制及肌肉營養(yǎng)品質(zhì)的環(huán)境調(diào)節(jié)機理積累基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及馴化

實驗用大菱鲆幼魚取自山東省煙臺天源水產(chǎn)有限公司, 初始體質(zhì)量為(7.16±0.07) g, 健康活潑。幼魚運輸?shù)綄嶒灮睾? 分別投放在容積為240 L的鋼化玻璃桶中暫養(yǎng)1周, 26尾/桶, 盛水140 L, 養(yǎng)殖用水為深井過濾海水, 鹽度為30(30組, 對照組)。高鹽度和低鹽度由深井過濾海水與海水晶或淡水調(diào)配而成, 采用每天鹽度升降1~2.5分別調(diào)至12(12組) 、18 (18組)、24(24組)、36(36組)等 4個鹽度梯度, 每鹽度組設(shè)3個重復組, 實驗期間水溫為14.2~19.9℃,pH為7.67~8.04, 溶解氧為6.55~8.61 mg/L, 總氨氮低于 0.17 mg/L, 自然光照, 連續(xù)充氣。大菱鲆幼魚在預定的鹽度環(huán)境中適應(yīng) 1周后正式開始實驗。采取飽食投喂方式投喂, 每天投食2次(08: 30和16: 30),每天早上投餌1 h后, 虹吸法吸去殘余餌料和排泄物,換水率為100%, 實驗為期60 d。

1.2 樣品采集和分析

飼養(yǎng)大菱鲆幼魚60 d后, 每桶隨機撈取16尾幼魚, 稱質(zhì)量后取下幼魚的所有肌肉混合勻漿, 真空冷凍干燥機(25superES3, VIRTIS美國)冷凍干燥后,采用高效液相色譜儀和氣相色譜儀分別測定大菱鲆幼魚肌肉中氨基酸和脂肪酸的含量。

1.2.1 氨基酸測量方法及步驟

參照 GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》的方法進行樣品處理。然后使用高效液相色譜儀測量肌肉氨基酸組成, 具體步驟如下:

準確稱取樣品20 mg放置于安培瓶中, 加入10 mL濃度為 6 mol/L鹽酸, 充氮氣后封管, 放置于110℃烘箱中水解24 h后減壓蒸干, 然后用0.02 mol/L鹽酸定容至10 mL。

采用異硫氰酸苯酯柱前衍生法: 量取制備好的樣品200 μL, 轉(zhuǎn)移到1mL離心管中, 加入100 μL三乙胺溶液和100 μL異硫氰酸苯酯, 混勻, 室溫放置1 h,然后加入400 mL正己烷振搖后放置10 min, 取下層溶液, 用0.45 μm膜過濾上高效液相色譜儀。

儀器: Waters alliance高效液相色譜儀; 色譜柱:Venusil-AA 氨基酸分析柱(4.6 m×250 mm×5 μm); 柱溫: 40℃; 檢測波長: 254 nm; 流動相A: 0.1mol醋酸鈉(含7%乙腈); 流動相B: 80%乙腈; 流速: 1mL/min 梯度洗脫。

1.2.2 脂肪酸測量方法及步驟

參照GB/T 9695.2—2008《肉與肉制品脂肪酸測定》的方法進行樣品處理。然后, 樣品脂肪酸在催化劑作用下與甲醇反應(yīng)生成脂肪酸甲酯, 進氣相色譜儀, 采用面積歸一化法對其組成進行分析。具體步驟如下:

1.2.2.1 脂肪的提取

用石油醚提取, 用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑, 得到脂肪提取物。

1.2.2.2 脂肪酸甲脂制備

采用三氟化硼法, 對樣品進行處理: 100 mg脂肪酸提取物放置50 mL燒瓶中, 加入0.5 mol/L的氫氧化鈉甲醇溶液4 mL, 加熱回流10 min進行脂肪的皂化; 再加入適量的 14%的三氟化硼甲醇溶液, 回流3 min, 進行脂肪的甲酯化。然后, 加入適量的異辛烷, 加入20 mL飽和NaCl溶液, 搖勻, 靜置10 min,再用移液管取出2 mL上層的異辛烷層轉(zhuǎn)移到試管中,加入適量的無水硫酸鈉脫水后, 進行氣相色譜分析。

1.2.2.3 上機

脂肪酸分析采用毛細管氣相色譜法。用 Agilent 7890A型氣相色譜儀(美國安捷公司)和 DB-FFAP彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)進行分析。采用自動進樣系統(tǒng), 進樣體積為1.0 μL, 進樣口溫度為 220℃, 載氣為高純氮氣, 柱頭壓為 35.5 kPa, 流速為1.0 mL/min, 分流方式進樣, 分流比為10∶1。柱溫采用程序升溫法: 100℃保持3 min, 然后每分鐘升高10℃, 升到230℃后, 保持15 min?；鹧骐x子化檢測器(FID)溫度為280℃。37種脂肪酸混合標準品(47885-U)由美國 Supelco公司提供。對各脂肪酸的測定是在相同色譜條件下, 依據(jù)標準脂肪酸的保留時間來確定, 采用面積歸一化法計算各脂肪酸的質(zhì)量分數(shù)。

1.3 肌肉蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值評價參數(shù)

分別采用必需氨基酸指數(shù)(EAAI)、化學分(CS)和氨基酸分(AAS)作為評價鹽度對大菱鲆幼魚肌肉蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的影響指標, 計算公式分別為:

CS=待評樣品蛋白質(zhì)氨基酸含量(mg/g蛋白質(zhì))/雞蛋蛋白質(zhì)氨基酸含量(mg/g蛋白質(zhì))

AAS=待評樣品蛋白質(zhì)氨基酸含量(mg/g蛋白質(zhì))/(WHO/FAO評分模式氨基酸含量)(mg/g蛋白質(zhì))

其中,n為比較的氨基酸數(shù),t為待評的蛋白質(zhì);s為標準蛋白質(zhì), WHO為世界衛(wèi)生組織, FAO為世界糧油組織。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

實驗所得數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差(means±SD)表示, 采用 SPSS l6.0軟件進行單因素方差統(tǒng)計分析(one-way ANOVA), 當差異顯著(P<0.05)時, 再進行student-Newman-Keuls多重比較分析。

2 結(jié)果

2.1 鹽度對大菱鲆幼魚肌肉中氨基酸組成的影響

飼養(yǎng)60 d后, 各鹽度組的大菱鲆幼魚肌肉中氨基酸組成見表1。除色氨酸在酸水解過程中被破壞和半胱氨酸含量極低, 未檢測出來外, 共檢測出 16種氨基酸, 其中谷氨酸含量最高, 脯氨酸和組氨酸含量較低。天冬氨酸在5.25%±0.09%~6.03%±0.30%, 36組顯著高于 24組(P<0.05); 谷氨酸在 10.74%±0.80%~12.31%±0.65%, 12組和36組顯著高于24組(P<0.05); 甘氨酸在 3.64%±0.21%~3.86%±0.13%, 各鹽度組間差異不顯著(P>0.05); 丙氨酸在 4.44%±0.06%~4.81%±0.14%, 36組顯著高于12組、18組和24組(P<0.05)。氨基酸總量(TAA)、必需氨基酸(EAA)總量、非必需氨基酸(NEAA)總量和呈味氨基酸(FAA)總量分別在69.25%±0.37%~74.85%±1.26%、31.70%±0.11%~33.74%±0.28%、31.29%±0.44%~34.60%±1.26%和24.20%±0.66%~26.98%±1.02%, 從高到低依次為 36組>30組>12組>18組>24組, 36組均顯著高于24組(P<0.05)。支鏈氨基酸(BCAA)總量、EAA/TAA、EAA/NEAA和 FAA/TAA分別在 14.94%± 0.34%~15.37%±0.18%、44.57%±1.20%~45.78%±0.26%、80.40%±3.93%~84.42%±0.89%和 34.95%±0.70%~36.41%±1.33%, 各鹽度組間均無顯著性差異(P>0.05)。

表1 鹽度對大菱鲆幼魚肌肉氨基酸組成的影響(%)(平均值±標準差, n=3)Tab.1 Effect of different salinities on amino acid composition (%) in muscle of juvenile turbot (S.maximus) (means ± SD, n=3)

飼養(yǎng)60 d后, 各鹽度下大菱鲆幼魚肌肉的必需氨基酸指數(shù)在40.41±1.23~44.46±0.54, 其中, 36組最大, 12組最小, 30組和36組顯著大于其他3個鹽度組(P<0.05), EAAI值隨鹽度的升高而增大(表2)。

飼養(yǎng)60 d后, 各鹽度下的大菱鲆幼魚肌肉蛋白質(zhì)的化學分見表3。從表3中得知, (蛋氨酸+半胱氨酸)得分最低, 其分值隨鹽度的升高而增大, 其次是蘇氨酸。因此, 各鹽度組的第一限制氨基酸為(蛋氨酸+半胱氨酸), 第二限制氨基酸為蘇氨酸。

飼養(yǎng)60 d后, 各鹽度下的大菱鲆幼魚肌肉蛋白質(zhì)的氨基酸分見表4。從表4中可以看出, 除了蘇氨酸和(蛋氨酸+半胱氨酸)稍低外, 其他氨基酸分AAS均接近或者大于1。其中, 賴氨酸的氨基酸分AAS最高, 接近或大于2。

表2 不同鹽度下大菱鲆幼魚肌肉蛋白的必需氨基酸指數(shù)(EAAI)(平均值±標準差, n=3)Tab.2 EAAI of muscle protein in juvenile turbot (S.maximus) reared at different salinities (means ± SD, n=3)

表3 不同鹽度下大菱鲆幼魚肌肉蛋白質(zhì)的化學分(CS)(平均值±標準差, n=3)Tab.3 CS of muscle protein in juvenile turbot (S.maximus) reared at different salinities (means ± SD, n=3)

表4 不同鹽度下大菱鲆幼魚肌肉蛋白質(zhì)的氨基酸分(AAS)(平均值±標準差, n=3)Tab.4 AAS of muscle protein in juvenile turbot (S.maximus) reared at different salinities (means ± SD, n=3)

由此可知, 鹽度越高, 大菱鲆幼魚肌肉中的氨基酸越符合 FAO/WHO中的必需氨基酸指數(shù)評分標準; 大菱鲆幼魚肌肉中的限制性氨基酸主要是蘇氨酸和(蛋氨酸+半胱氨酸)。

2.2 鹽度對大菱鲆幼魚肌肉中脂肪酸組成的影響

飼養(yǎng)60 d后, 各鹽度下大菱鲆幼魚肌肉中脂肪酸組成見表5。從表5可知, 共檢測出23種脂肪酸,其中, 飽和脂肪酸(SFA)為 4種, 單不飽和脂肪酸(MUFA)為6種, 多不飽和脂肪酸(PUFAS)為13種。脂肪酸總量(TFA)在 88.65%±0.68%~89.66%±0.32%,其中, 12組最高, 18組最低, 18組顯著低于12組和30組(P<0.05)。必需脂肪酸總量(EFA)在 3.28%±0.04%~3.58%±0.10%, 其中, 24組最高, 12組最低,各鹽度組間差異不顯著(P>0.05)。非必需脂肪酸總量(NEFA)在 85.11%±0.78%~86.38%±0.37%, 其中, 12組最高, 18組最低, 12組和 30組顯著高于 18組(P<0.05)。SFA總量在27.51%±0.37%~29.83%±0.35%, 其中, 12組最高, 36組最低, 12組顯著高于36組(P<0.05),總體上, SFA總量隨鹽度的升高而降低。EPA+DHA和PUFAS總量分別在 23.53%±1.30%~25.74%±0.25%和34.95%±1.01%~36.88%±0.64%, 各鹽度組間均無顯著性差異(P>0.05), 其含量從高到低依次為 36組>30組>24組>12組>18組, 總體上隨鹽度的升高而增大。

3 討論

魚類體液中的離子組成和濃度與其外圍水環(huán)境中的差別很大[13], 必須通過滲透壓調(diào)節(jié)來維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定, 這一過程需要消耗大量的能量。與碳水化合物相比, 氨基酸和脂肪酸可以充當氧化底物為滲透壓調(diào)節(jié)提供能量通常更容易被忽略[1]。目前, 僅有少量研究綜合討論了海水馴化過程中機體內(nèi)氨基酸和脂肪酸含量的變化[2-7]。研究表明: 脂肪酸尤其是非必需脂肪酸作為魚類主要的貯能物質(zhì)[14], 可以為滲透壓調(diào)節(jié)提供大量的能量[2,4], 同時, 氨基酸也可以通過以下幾條途徑產(chǎn)生能量: (1)非必需氨基酸如天冬氨酸、丙氨酸通過聯(lián)合脫氨基作用產(chǎn)生能量[5];(2) 天冬氨酸和丙氨基被各自的氨基酸轉(zhuǎn)移酶氧化后, 體內(nèi)谷氨酸含量在沒有谷氨酸脫氫酶脫氨基的情況下增加[4], 谷氨酸是滲透壓調(diào)節(jié)過程中另外一種能量來源; (3)支鏈氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)通過支鏈氨基酸轉(zhuǎn)移酶氧化產(chǎn)生谷氨酸。本研究表明, 36組的支鏈氨基酸總量、天冬氨酸、丙氨酸和谷氨酸含量均高于對照組, 非必需脂肪酸總量低于對照組; 18組和24組的非必需脂肪酸總量、丙氨酸、支鏈氨基酸和谷氨酸含量均低于對照組; 12組的支鏈氨基酸總量、非必需脂肪酸總量和谷氨酸含量高于對照組, 天冬氨酸和丙氨酸含量低于對照組。甘氨酸作為滲透壓調(diào)節(jié)的“細胞溶質(zhì)”, 各鹽度組間均差異不顯著。由此可見, 水環(huán)境中的鹽度可以通過改變新陳代謝途徑來影響大菱鲆幼魚肌肉中的氨基酸和脂肪酸含量, 從而為滲透壓調(diào)節(jié)提供能量。至于能量主要由糖類、脂類還是蛋白質(zhì)供給, 及通過哪些代謝途徑提供, 需要測定魚類的氧氮比(O/N)[15], 同時對血液和組織中能量代謝相關(guān)酶的活性及其基因表達水平等進行更深入的研究。

蛋白質(zhì)是評價肌肉品質(zhì)最重要的指標之一, 而蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的。因此, 氨基酸組成是一項非常重要的肌肉品質(zhì)評價指標。根據(jù)WHO/FAO理想模式, 質(zhì)量較好的蛋白質(zhì)其必需氨基酸總量與氨基酸總量之比(EAA/TAA)為 40%左右, 必需氨基酸總量與非必需氨基酸總量之比(EAA/NEAA)為60%以上[16]。各鹽度組幼魚肌肉中的EAA/TAA、EAA/NEAA 分別在 44.57%±1.20%~45.78%±0.26% 、80.40%±3.93%~84.42%±0.89%, 均符合 WHO/FAO理想模式要求, 說明大菱鲆肌肉是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來源。各鹽度組間幼魚肌肉的氨基酸總量、必需氨基酸總量、非必需氨基酸總量和呈味氨基酸總量等均存在差異, 四者數(shù)值從高到低依次為36組> 30組> 12組> 18組> 24組, 且24組均顯著低于36組,這與烏鱧(Channa argus)肌肉中氨基酸總量和呈味氨基酸總量隨鹽度的升高而增加的研究結(jié)果不一致[11],其主要原因可能是魚的種類、鹽度的變幅、馴化時間及飼養(yǎng)管理等不同。必需氨基酸指數(shù)(EAAI)是評價食物蛋白質(zhì)營養(yǎng)的常用指標之一, 它是以雞蛋蛋白質(zhì)必需氨基酸為評價標準。EAAI值隨鹽度的升高而增大, 30組和36組顯著高于其他鹽度組。因此, 升高鹽度(36組)可以增加大菱鲆幼魚肌肉中氨基酸總量、必需氨基酸總量、非必需氨基酸總量等, 并增強其風味, 從而提高其氨基酸質(zhì)量, 降低鹽度則剛好相反。根據(jù)化學分CS和氨基酸分AAS可知(表3, 表4), (蛋氨酸+胱氨酸)和蘇氨酸是大菱鲆幼魚肌肉中最主要的限制性氨基酸, 其值隨鹽度的降低而減少。

表5 鹽度對大菱鲆幼魚肌肉脂肪酸組成的影響(%) (平均值±標準差, n=3)Tab.5 Effect of the different salinities on fatty acid composition (%) in muscle of juvenile turbot (S.maximus) (means ±SD, n=3)

在魚類中, 脂類主要是由多不飽和脂肪酸(PUFAS)所構(gòu)成[17]。其中包括 n-3PUFAS、EPA+DHA, 它們具有降血壓、降血脂、抑制血小板聚集、抗腫瘤、消炎和免疫調(diào)節(jié)等多種功效[18]。36組幼魚肌肉脂肪酸組成和含量的分析結(jié)果表明, 脂肪酸總量(TFA)和SFA總量略低于對照組, 而必需脂肪酸總量(EFA)、PUFAS和EPA+DHA均高于對照組(表5)。對于18組和24組而言, TFA、PUFAS和EPA+DHA均低于對照組, 而EFA和SFA總量均高于對照組。對于12組而言, TFA和SFA總量高于對照組, 而EFA、PUFAS和EPA+DHA均低于對照組, 即與36組相好相反。因此,提高養(yǎng)殖鹽度有利于增加EFA、PUFAS和EPA+DHA等脂肪酸含量, 同時降低TFA和SFA總量等。與王艷等[12]有關(guān)鹽度對鱸魚脂肪酸影響的結(jié)論剛好相反。其主要原因可能與魚的種類、鹽度馴化的強度和時間及飼養(yǎng)管理等密切相關(guān), 其機理有待進一步研究。

4 小結(jié)

養(yǎng)殖水體的鹽度發(fā)生變化時, 大菱鲆幼魚通過調(diào)整新陳代謝途徑來獲取滲透壓調(diào)節(jié)所需求的能量,從而顯著影響肌肉中的氨基酸和脂肪酸含量。本研究表明, 與對照組(30組)相比, 提高水體鹽度(36組),有利于提高大菱鲆幼魚肌肉中TAA、EAA、NEAA、FAA、EFA、PUFAS和EPA+DHA等含量, 同時降低SFA總量, 從而提高了氨基酸和脂肪酸的質(zhì)量, 而降低鹽度則剛好相反。因此, 在一定范圍內(nèi), 提高鹽度有利于改善蛋白質(zhì)和脂肪酸的質(zhì)量。本研究為闡明大菱鲆滲透壓調(diào)節(jié)的能量代謝機制及肌肉營養(yǎng)品質(zhì)的環(huán)境調(diào)節(jié)機理積累了基礎(chǔ)資料。

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