董 樂, 姚麗梅, 戴聰杰, 張 樂, 黃蘋蘋, 王建穎

(泉州師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 近海資源生物技術(shù)福建省高校重點實驗室, 福建 泉州 362000)

肌動蛋白(Actin)是構(gòu)成細胞骨架的主要成分[1],幾乎參與了真核細胞的所有生理過程, 如細胞分裂、染色體運動、細胞器運動、細胞激化、胞質(zhì)流動、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、mRNA 加工和運輸?shù)萚2-4]。肌動蛋白有6 種異構(gòu)體, 根據(jù)等電點的不同分為α、β、γ 3類:兩個橫紋肌(α-骨骼肌型, α-心肌型), 兩個平滑肌(α-血管平滑肌型, γ-內(nèi)臟平滑肌型), 兩個細胞質(zhì)型(β和γ亞型)[5]。其中, β-actin 除具氨基酸序列高度保守性外, 還能在不同的組織中持續(xù)衡量的表達, 且其表達量高, 因此在研究某個基因 mRNA及蛋白質(zhì)的相對表達量時, 常分別采用 β-actin 基因的 mRNA 和β-actin作為內(nèi)標(biāo)[6-9]。但近年來也有研究表明, β-actin基因有時也會受到生理狀態(tài)或者環(huán)境的調(diào)控而出現(xiàn)表達水平的差異[10-12]。因此, 在采用 β-actin及其基因作為分子內(nèi)標(biāo)開展實驗研究時, 必須首先評價其在該物種中的表達特征。

迄今, 鰱(Hypophthalmichthys molitrix)、真鯛(Pagrosomus major)、斑馬魚(Danio rerio)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、(Elopichthys bambusa)、尖頭(Phoxinus oxycephalusSauvage et Dabry)、團頭魴(Megalobrama amblycephala)、鯉(Cyprinus carpio)、草魚(Ctenopharyngodon idella)、斜帶石斑魚(Epinephelusco joides)、大西洋鮭(Salmo salar)、羅非魚(Oreo-chromis mossambicus)、松江鱸(Trachidermus fasciatus)等硬骨魚類的 β-actin基因已被克隆[13-14]。大黃魚(Larimichthys crocea)系鱸形目(Perciformes)、石首魚科(Sciaenidae)、黃魚屬(Pseudosciaena), 是中國海洋主要經(jīng)濟魚類之一[15]。對大黃魚功能基因的挖掘與利用的研究極為重要。大黃魚 β-actin基因(LcActb)全長cDNA序列已被提交GenBank(GU 584189.1;FJ936563.1), 但其在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上組織表達譜的研究尚未見報道。

本研究采用RT-PCR技術(shù)克隆LcActb的開放閱讀框(Open reading frame, ORF), 同時, 將其亞克隆到原核表達載體上進行表達, 并制備和純化抗LcActb的多克隆抗體, 通過實時熒光定量PCR(qRTPCR)和Western blotting方法, 分析LcActb在肌肉、心臟、肝臟等 8 個組織中的表達模式, 為探討其作為內(nèi)參基因進行相關(guān)研究的可行性, 也為進一步研究大黃魚功能基因的差異表達提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

成熟大黃魚 (全長 410~450 mm)活體購于福建省寧德市海洋技術(shù)開發(fā)有限公司, 解剖后, 取其心臟、肝、脾、腸、胃、腎、肌肉和幽門垂共8 種組織,立即凍存于液氮中, 帶回實驗室后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。雌、雄魚各取 5 尾, 用于提取克隆LcActb的ORF序列和分析LcActb組織表達所需的總RNA。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增LcActb的ORF序列

以常規(guī) Trizol 法提取各組織的總 RNA后, 按Invitrogen公司的試劑盒說明書進行 mRNA的純化和cDNA第一鏈的合成。以合成的肝臟cDNA第一鏈為模板, 根據(jù)已克隆的LcActb全長 cDNA序列(GenBank accession: GU584189.1; FJ936563.1)設(shè)計 1對特異性引物, 以此進行 PCR擴增得到LcActb的ORF序列, 引物序列如下;

P1: 5′- CCCAAGCTT(Hind III識別位點)ATGG AAGATGAAATCGCCGC;

P2: 5′- CCGCTCGAG(XhoI識別位點)TTAGAA GCATTTGCGTTTGCGGTGGAC,

引物由上海生工生物技術(shù)工程服務(wù)有限公司合成。

PCR 反應(yīng)體系為 50 μL, 其中包括 10 mmol/L Tris-HCl (pH8.3)、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L dNTPs、10-4mmol/L P1、10-4mmol/L P2、1 unit Taq DNA polymerase。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性1 min, 50 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1 min,循環(huán)數(shù)35 個; 72 ℃再延伸10 min。

1.2.2LcActb原核表達載體的構(gòu)建

按文獻[16]進行; DNA測序由上海生工生物技術(shù)工程服務(wù)有限公司進行;LcActb的 ORF序列分析用DNA Strider 1.2。

1.2.3 pET32a-LcActb在大腸桿菌中的表達及可溶性分析

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21, 挑取陽性單菌落,活化后進行誘導(dǎo)表達, 同時設(shè)未誘導(dǎo)對照。其中,IPTG 分別設(shè)置為 0.1、0.2、0.4、0.6、0.7、0.8 mmol/L,誘導(dǎo)溫度分別設(shè)置為18、24、28、34、37 ℃, 誘導(dǎo)時間分別設(shè)置為 2、3、4、5、6、7 h。重組表達蛋白可溶性分析按文獻[16]進行。用SDS-PAGE電泳檢測表達產(chǎn)物, 分離膠濃度為12%。

1.2.4 LcActb的純化

重組菌按上述探索好的條件大量表達。LcActb的純化按QIAGEN公司Ni-NIA Agarose試劑盒說明書進行, 并用SDS-PAGE 鑒定蛋白純度。

1.2.5 LcActb抗血清的制備及效價檢測

按文獻[17]進行。

1.2.6 LcActb抗血清IgG的純化

按文獻[18]進行。

1.2.7 Western Blotting 分析

按文獻[16]進行。其中, 鼠抗His單克隆抗體作為一抗(1: 3000), 辣根過氧化物酶( HRP) 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 為二抗(1: 4000), 用ECL發(fā)光試劑盒曝光充分顯色, 拍片保存。

1.2.8LcActb在大黃魚各組織的表達

分別提取心臟、肝、脾、腸、胃、腎、肌肉和幽門垂共8 種組織的RNA后, 進行qRT- PCR。引物序列如下,

qAct1: ACGCCAACACCGTGCTGTC;

qAct2: TTAGAAGCATTTGCGGTGGAC,

引物由上海生工生物技術(shù)工程服務(wù)有限公司合成。

qRT- PCR 反應(yīng)體系為 15 μL: Mix 7.5 μL, qAct1 0.15 μL; qAct2 0.15 μL; cDNA 1.5 μL; RNase Free ddH2O 補至 15 μL。

于 StepOnePlus?實時熒光定量 PCR 系統(tǒng)上擴增, 程序為: 50 ℃ , 2 min; 95 ℃ , 10 min; 95 ℃ , 15 s,60 ℃ , 1 min,循環(huán)數(shù)40 個。PCR 擴增產(chǎn)物先用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。LcActbmRNA相對表達水平用 2–ΔΔCT法計算[19]。每個樣品重復(fù) 3 次。以肝臟的表達水平作對照, 目的基因相對表達量用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 數(shù)據(jù)分析采用 SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件,Duncan法進行多重比較, 當(dāng)P<0.05 時差異顯著。

1.2.9 LcActb在大黃魚各組織的表達

從心臟、肝、脾、腸、胃、腎、肌肉和幽門垂共 8 種組織中提取總蛋白。采用 Bradford 方法[20]定量蛋白質(zhì)后, 每個組織取 1 mg 蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE分析, 分離膠濃度為 12%。經(jīng) Western Blotting檢測 LcActb 在大黃魚各組織中的表達情況。實驗經(jīng)3 次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET32a-LcActb的構(gòu)建及鑒定

LcActbORF的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后, 將預(yù)期大小的 PCR產(chǎn)物與 pET32a(+)載體用T4DNA 連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,經(jīng)選擇性培養(yǎng)基篩選和雙酶切鑒定, 挑選陽性重組質(zhì)粒進行測序。測序結(jié)果表明(圖1), 該片段長1128 bp,編碼375個氨基酸殘基組成的肽段。序列分析表明, 該片段序列與原序列一致, 閱讀框架正確, 目的基因插入正確, 顯示重組表達載體pET32a-LcActb構(gòu)建成功。

圖1 LcActb的ORF序列和推斷的氨基酸序列Fig.1 The cDNA and predict amino acid sequences of the LcActb ORF in L.crocea

2.2 LcActb蛋白原核表達、可溶性分析及純化

pET32a-LcActb重組菌經(jīng)菌落 PCR檢測后, 隨機挑取 1個陽性菌, 加 IPTG 誘導(dǎo)表達。pET32a-LcActb誘導(dǎo)表達量隨溫度升高而增多, 至 28 ℃時,其表達量達最高后, 又隨溫度升高而減少。故選擇誘導(dǎo)溫度為 28 ℃, 結(jié)果見圖2A。由于目的蛋白為41.701 ku, 加上質(zhì)粒 pET-32a(+)在多克隆位點上游有一段編碼序列, 融合蛋白約為45~47 ku。實驗結(jié)果與預(yù)期的目的蛋白大小相符。不同時間誘導(dǎo)時, 誘導(dǎo)5 h 后誘導(dǎo)表達量增多, 故選擇誘導(dǎo)時間為 5 h, 結(jié)果見圖2B; 不同 IPTG 濃度誘導(dǎo)時, IPTG 濃度從0.1 mmol/L 到0.8 mmol/L 誘導(dǎo)時, 表達量最大時的IPTG 濃度為0.4 mmol/L, 結(jié)果見圖2C; 用IPTG 濃度為0.4 mmol/L 誘導(dǎo)表達的BL21 重組菌經(jīng)離心收集菌體, 菌體經(jīng)超聲波裂解, 用 SDS-PAGE 分析裂解后的上清和沉淀, pET32a-LcActb表達蛋白存在菌體裂解液沉淀中, 即以包涵體形式表達, 結(jié)果見圖2D。

純化的LcActb用SDS-PAGE進行分析, 結(jié)果只含有一條目的蛋白帶(圖3A)。蛋白濃度為1.67 g/L。經(jīng) Western blotting 驗證, 泳道上出現(xiàn)蛋白特異性的反應(yīng)條帶(圖3B)。實驗結(jié)果表明, LcActb表達成功。

2.3 抗LcActb抗血清制備及其效價檢測和特異性分析

以純化LcActb為抗原制備抗血清。以未免疫的兔血清作為陰性對照, 將免疫的兔抗血清做不同稀釋后, 進行 ELISA檢測。標(biāo)本孔的吸收值與陰性標(biāo)本孔的吸收值的比值(P/N)大于 2.1時判斷為陽性。結(jié)果表明, LcActb的兔抗血清效價達到1 ∶ 1.00×106。

圖2 pET32a-LcActb原核表達條件的優(yōu)化及可溶性分析SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE analysis of optimized expression condition and the protein solubility of pET32a-LcActb in E. coli

圖3 LcActb蛋白純化的 SDS-PAGE圖譜和 Western blotting 驗證Fig.3 SDS-PAGE and Western blotting analysis of purified LcActb

Western blotting結(jié)果顯示, 用免疫前的血清進行實驗時不顯示條帶; 未純化的抗血清由于含有很多非特異性抗體, 所以有非特異性條帶; 而用純化的LcActb特異性的抗體(1: 1000 稀釋), 則無非特異性條帶(圖4)。以上結(jié)果表明, 制備和純化后的LcActb 多克隆抗體特異性較強。

2.4 LcActb基因在大黃魚各組織的表達

利用qRT- PCR方法分析LcActb在大黃魚心臟、肝、脾、腸、胃、腎、肌肉和幽門垂共8 種組織的表達及差異, 結(jié)果顯示,LcActb在這些組織中均有表達。

應(yīng)用2–ΔΔCT法計算LcActb在各組織中的表達量,以肝的表達量為 1 計算,LcActb在各組織的表達量無顯著性差異(圖5)。

利用Wester blotting 方法分析LcActb在大黃魚上述8 種組織的表達及差異, 結(jié)果顯示(圖6), LcActb在這些組織中含量無顯著差異。

圖4 純化的多克隆抗體的Western blotting特異性分析Fig.4 Western blotting analysis of purified LcActb antibody

圖5 LcActb在不同組織中的表達量Fig.5 Expression pattern of LcActb in different tissues of L.crocea

圖6 LcActb在不同組織中的含量Fig.6 Expression pattern of LcActb in different tissues of L.crocea

3 討論

一直以來, 在分子生物學(xué)領(lǐng)域的基因 mRNA的相對表達研究中, 由于β-actin具有時空恒定表達的特性而成為最常用的內(nèi)參基因。但近年來有研究認為,β-actin在有些物種、某些情況下并不適合作為內(nèi)參基因。其一,β-actin表達水平在不同的外界環(huán)境或生理條件下可能存在顯著的差異[20-21], 如廣溫性鯉(Cyprinus carpio)冷適應(yīng)機制的研究表明,β-actin的表達水平在冬季和夏季存在顯著性差異[22]。其二,β-actin基因的表達水平在生物不同的生長階段也有所不同[23], 如斑馬魚 β-actin基因表達量在腦神經(jīng)細胞增殖時過表達[24]。其三, β-actin 基因受某些疾病的影響表達量也有所不同, 如在哮喘患者氣道中β-actin基因的表達水平比正常組織中的表達水平低10倍[11]。這說明, 在利用β-actin作為內(nèi)參進行基因表達研究時, 首先要對其作為分子內(nèi)參的可靠性進行評估。

本研究通過qRT-PCR 檢測得到的結(jié)果表明, 大黃魚LcActb的mRNA 在所采集的成體魚心臟、肝、脾、腸、胃、腎、肌肉和幽門垂共 8種組織中的表達差異均不顯著。這與寬體沙鰍(Botia reevesae)[13]、鳡(Elopichthys bambusa)[14]、三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)[25]、黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)[26]中的研究結(jié)果基本一致。但迄今, 關(guān)于魚類β-actin表達的研究都沒有從不同的發(fā)育階段及外界環(huán)境或生理條件對其影響等方面進行系統(tǒng)的展開, 基本上僅限于基因在某一時期不同組織中的表達差異方面進行分析。本研究只研究了成體魚不同組織中LcActb的表達情況, 至于,LcActb表達水平在不同的生長階段、在不同的外界環(huán)境或生理條件下是否存在差異,將是我們下一步要深入研究的問題。因此,LcActb可作為研究大黃魚成體魚中其他基因表達轉(zhuǎn)錄水平時的內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)。

mRNA 的相對量說明了β-actin在轉(zhuǎn)錄水平是否存在差異; 蛋白質(zhì)的相對量能進一步表明β-actin在轉(zhuǎn)錄后水平的差異?，F(xiàn)有文獻也基本上只針對于前一個方面開展研究。本研究進一步分析了LcActb在轉(zhuǎn)錄后的蛋白質(zhì)水平的差異。Western blotting檢測的結(jié)果表明,LcActb在轉(zhuǎn)錄后水平也無差異, 即LcActb在8 種組織中表達量恒定。因此,LcActb可作為研究大黃魚成體魚中其他基因表達轉(zhuǎn)錄后水平的內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)。

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