劉亞莉等

[摘要] 目的 研究高脂飲食喂養(yǎng)小鼠附睪周圍和皮下來源的脂肪細(xì)胞血漿纖溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）、叉頭框蛋白C2（FOXC2）及叉頭框蛋白O1（FOXO1）表達(dá)水平，探討不同類型肥胖的機(jī)制。 方法 20只小鼠隨機(jī)分為對照組和高脂組，分別給予正常飲食和高脂飲食喂養(yǎng)12周。取其附睪周圍及皮下脂肪組織，原代培養(yǎng)前脂肪細(xì)胞經(jīng)分化后，Western blot法測定脂肪細(xì)胞中PAI-1的蛋白表達(dá)水平，并用RT-PCR法檢測胰島素作用前后高脂組附睪周圍及皮下脂肪細(xì)胞FOXC2和FOXO1的mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果 高脂組小鼠體重顯著高于對照組（P < 0.05）；組內(nèi)比較小鼠附睪周圍脂肪組織PAI-1表達(dá)顯著高于皮下脂肪組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；胰島素作用后，F(xiàn)OXC2 mRNA水平有所升高，附睪附近脂肪細(xì)胞升高明顯，與皮下脂肪細(xì)胞相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；胰島素作用后，F(xiàn)OXO1 mRNA表達(dá)有所降低，附睪附近脂肪細(xì)胞降低明顯，與皮下脂肪細(xì)胞相比，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 高脂小鼠附睪周圍和皮下來源的脂肪細(xì)胞的PAI-1表達(dá)不同，胰島素作用后FOXC2及FOXO1的表達(dá)存在差別，這種差別可能是不同類型肥胖的機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞] 血漿纖溶酶原激活物抑制物-1；叉頭框蛋白C2；叉頭框蛋白O1；細(xì)胞培養(yǎng)

[中圖分類號] R3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）11（a）-0023-05

Effects of insulin on PAI-1， FOXC2 and FOXO1 expression of adipocyte from subcutaneous and around the epididymis of high fat diet mice

LIU Yali1 YI Jiali2 LIU Yiqun1 LIU Jianhui1

1.Department of Health Inspection， Liaoning Medical Vocational College， Liaoning Province， Shenyang 110101， China； 2.Dean's Office， Liaoning Medical Vocational College， Liaoning Province， Shenyang 110101， China

[Abstract] Objective To research the expression of PAI-1， FOXC2 and FOXO1 in adipocyte from subcutaneous and around the epididymis in mice feeding high-fat diet， in order to explore the mechanism of different types of obesity. Methods 20 mice were randomly divided into control group and high fat group. The control group was given normal diet and the high fat group was given high fat diet. After 12 weeks， rats epididymal adipose tissue was taken out to culture preadipocytes， and then differentiationed， the fat cell PAI-1 protein expression was detected by Western blot method. The FOXC2 and FOXO1 mRNA expression before and after insulin action in hyperlipidemia groupepididymal and subcutaneous fat cells around were detected by RT-PCR assay. Results Body weight in high fat group was significantly higher than the control group （P < 0.05）. Within the two groups， PAI-1 expression in adipocyte around the epididymis was significantly higher than the subcutaneous adipose tissue， the difference was statistically significant （P < 0.05）. After effects of insulin FOXC2 mRNA levels increased， epididymal fat cells increased obviously， there was statistically significant difference compared with subcutaneous fat cells（P < 0.05）； the expression of FOXO1 mRNA significantly decreased， epididymal fat cells decreased obviously， there was statisticaly significant difference compared with subcutaneous fat cells （P < 0.05）. Conclusion Different expression in PAI-1 from hyperlipidemic mice subcutaneous and visceral adipose cells， after the action of insulin， there are differences of FOXC2 and FOXO1 expressions. The difference may be one of mechanisms of different types of obesity.

[Key words] PAI-1； FOXC2； FOXO1； Cell culture

隨著人們生活節(jié)奏的加快和飲食結(jié)構(gòu)的改變，肥胖已經(jīng)成為一個(gè)相當(dāng)嚴(yán)重的社會問題，這種以體重增加和脂肪組織異常堆積為特點(diǎn)的能量攝入過剩的病理狀態(tài)，已經(jīng)成為威脅人類健康的三大流行慢性疾病之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖和超重與胰島素抵抗、心血管疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)、睡眠呼吸功能紊亂及某些癌癥發(fā)病密切相關(guān)。然而，對于肥胖人群而言，脂肪分布比脂肪總量的危害更大。臨床研究證實(shí)與皮下脂肪相比，內(nèi)臟脂肪才是導(dǎo)致胰島素抵抗、心血管疾病及血脂異常的重要危險(xiǎn)因素[2]。本研究選用正常小鼠和高脂飲食小鼠的皮下和內(nèi)臟來源的脂肪細(xì)胞為研究對象，檢測與肥胖、糖尿病及心血管疾病密切相關(guān)的因子血漿纖溶酶原激活物抑制物-1（plasminogen activator inhibitor，PAI-1）的表達(dá)差異，以及胰島素在體外干擾脂肪細(xì)胞時(shí)，對翼狀螺旋叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族的叉頭框（Forkhead box）蛋白C2（FOXC2）和叉頭框蛋白O1（FOXO1）表達(dá)的影響，探討不同類型肥胖可能的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胎牛血清（FBS）、DME/F-12培養(yǎng)基、紅油O購于Hyclone公司，PAI-1抗體購于PTGLAB公司，Triozol Reagent購于美國Invitrogen Life technologies公司，F(xiàn)OXC2及FOXO1熒光定量PCR試劑盒購于寶生物工程（大連）有限公司，引物合成由北京華大基因公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物和分組

雄性C57BL/6小鼠20只，體重（20±2）g，購自北京維通利華動物實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心，動物許可證號為SCXK（京）2012-0001，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對照組和高脂組，各10只。對照組給予普通基礎(chǔ)飼料，高脂組給予高脂飼料（高脂飼料為基礎(chǔ)飼料中添加豬油和酪蛋白，使飼料58%能量來自脂肪，27%能量來自碳水化合物，15%能量來自蛋白質(zhì)[3]），喂養(yǎng)12周。自由飲水，每周稱重1次。

1.3 樣品細(xì)胞的收集

斷頸處死各組小鼠，75%酒精浸泡鼠體20 min。無菌操作，取雙側(cè)附睪脂肪墊及腹部皮下脂肪組織。用PBS漂洗脂肪墊，去除脂肪墊中肉眼可見的血管及纖維組織。將脂肪組織剪成1 mm3的小塊，放入無菌試管中，加2%的Ⅰ型膠原酶消化液，37℃水浴中消化。充分搖動，90 min后，加等量的DME/F-12培養(yǎng)基停止消化，用200目尼龍網(wǎng)過濾。取濾過液，1000 r/min離心10 min，棄上清液，加入10%DME/F-12培養(yǎng)基，吹打均勻，再以5×104個(gè)/mL濃度接種25 cm培養(yǎng)瓶中，每瓶5 mL培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后，吸棄培養(yǎng)基，以去除漂浮的紅細(xì)胞，重新加入含10%胎牛血清的DME/F-12培養(yǎng)基5 mL。2 d換液1次。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)[4]。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，長滿2/3瓶，進(jìn)行傳代。棄培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞，倒掉后，加胰蛋白酶消化液0.4 mL，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，于培養(yǎng)箱中放置1 min后，倒置顯微鏡觀察，細(xì)胞回縮變圓，倒掉消化液，加入DME/F-12培養(yǎng)基3 mL，用吸管輕柔吹打細(xì)胞后，倒置顯微鏡觀察見細(xì)胞懸浮，分成3瓶，完成傳代。

1.5 原代培養(yǎng)脂肪細(xì)胞的鑒定

采用油紅O脂肪染色法[5]，培養(yǎng)皿中的小鼠前脂肪細(xì)胞經(jīng)過6～7 d，細(xì)胞內(nèi)脂滴開始形成，13～15 d脂滴基本形成。用PBS洗3次，10%甲醛固定10 min后，PBS洗3次，細(xì)胞晾干20 min。加油紅O工作液靜止10 min。蘇木精染細(xì)胞核10 min后，自來水沖洗，甘油明膠封片，普通顯微鏡下觀察。

1.6 Western blot法檢測兩組皮下和附睪周圍來源的脂肪細(xì)胞中PAI-1的表達(dá)

提取各組脂肪細(xì)胞的總蛋白，4℃ 2000 r/min離心10 min，取上清，BCA試劑盒測定蛋白濃度，與5×SDS上樣緩沖液100℃煮沸5 min，以每孔60 μg加入10%SDS-PAGE凝膠中，電泳，轉(zhuǎn)膜3 h。用5%脫脂奶粉在37℃條件下封閉1 h。一抗4℃孵育過夜，TBST洗4次，在暗室用ECL發(fā)光，圖像掃描并分析結(jié)果。采用所測PAI-1條帶與內(nèi)參β-actin條帶的光密度比值來表示PAI-1蛋白的表達(dá)水平。

1.7 RT-PCR法檢測胰島素干擾前后高脂組脂肪細(xì)胞FOXC2和FOXO1 mRNA的表達(dá)

1.7.1 提取RNA 分化成熟的各組脂肪細(xì)胞，PBS洗滌后分別轉(zhuǎn)入含濃度為0.15 μmol/L[6]胰島素的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6 h后收獲細(xì)胞。按TRIzol說明書操作步驟，采取一步法提取總RNA，采用紫外分光光度計(jì)測定260 nm、280 nm OD值，樣品-80℃保存?zhèn)溆?。RNA濃度和純度測定取1 μL RNA樣本，加79 μL DEPC水，紫外分光光度計(jì)測OD260與OD280，二者比值應(yīng)為1.8～2.0，提示樣本中RNA純度合格。RNA（μg/μL）濃度=OD260×40×稀釋倍數(shù)/1000。各引物序列見表1。

1.7.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 反應(yīng)體系為10 μL，反應(yīng)條件為37℃，15 min；85℃，5 s，1個(gè)循環(huán)。

1.7.3 PCR擴(kuò)增 以cDNA為模板，GAPDH為參照，反應(yīng)體系為20 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min；95℃ 15 s，1個(gè)循環(huán)。

1.7.4結(jié)果判定 根據(jù)系統(tǒng)給出的Ct進(jìn)行結(jié)果判定。Ct目的-Ct內(nèi)參即為該標(biāo)本的ΔCt。計(jì)算出2-ΔΔCt，以代表脂肪組織mRNA的表達(dá)水平。

表1 GAPDH、FOXC2及FOXO1引物序列

注：FOXC2：叉頭框蛋白C2；FOXO1：叉頭框蛋白O1

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠體重變化比較

從第9周開始高脂組小鼠體重高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表2、圖1。

表2 兩組小鼠體重變化情況（g，x±s）

圖1 兩組小鼠體重變化情況

2.2 原代培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞鑒定

前體脂肪細(xì)胞3 h后開始貼壁，貼附后逐漸呈現(xiàn)梭形或不規(guī)則三角形。接種4～5 d后，細(xì)胞接觸并逐漸匯合，形成生長抑制。7～8 d后，細(xì)胞內(nèi)逐漸形成松散的脂滴，脂滴大小不一，最后脂肪滴聚集成葡萄串。2周后，脂肪細(xì)胞分化成熟，進(jìn)行油紅O染色。染色顯示，增大的脂肪滴將細(xì)胞核擠到一邊，脂肪滴呈橢圓形或圓形，大部分前脂肪細(xì)胞分化成為脂肪細(xì)胞。因?yàn)橛图tO與脂肪滴有特異結(jié)合的功能，故可鑒定為脂肪細(xì)胞。其中未分化的前脂肪細(xì)胞和非脂滴聚積的部分不著色。

2.3 Western blot法檢測兩組皮下和附睪周圍來源的脂肪細(xì)胞中PAI-1的表達(dá)

組內(nèi)比較，無論高脂組和對照組，附睪周圍脂肪組織PAI-1表達(dá)均高于皮下脂肪組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖2、3。

與高脂組皮下脂肪比較，*P < 0.05

圖2 兩組皮下和附睪周圍來源的脂肪細(xì)胞中PAI-1表達(dá)比較

A：對照組皮下脂肪細(xì)胞；B：對照組附睪周圍脂肪細(xì)胞；C：高脂組皮下脂肪細(xì)胞；D：高脂組附睪周圍脂肪細(xì)胞

圖3 兩組皮下和附睪周圍來源的脂肪細(xì)胞中PAI-1蛋白表達(dá)條帶

2.4 RT-PCR法檢測胰島素干擾前后高脂組脂肪細(xì)胞FOXC2和FOXO1 mRNA的表達(dá)

結(jié)果表明，0.15 μmol/L胰島素作用6 h前，高脂組皮下脂肪細(xì)胞和附睪周圍脂肪細(xì)胞FOXC2和FOXO1 mRNA的表達(dá)均有差異，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。0.15 μmol/L胰島素作用6 h后，高脂組皮下脂肪細(xì)胞和附睪周圍脂肪細(xì)胞FOXC2 mRNA的表達(dá)都有所升高，F(xiàn)OXO1 mRNA的表達(dá)都有所降低，附睪周圍脂肪細(xì)胞的表達(dá)量前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表3、4，圖4、5。

表3 胰島素作用前后高脂組皮下脂肪細(xì)胞和附睪周圍脂肪細(xì)胞

叉頭框蛋白C2 mRNA表達(dá)情況（x±s）

注：與胰島素作用前同部位比較，*P < 0.05

3 討論

本實(shí)驗(yàn)的造模方法與人類的生活方式如高脂肪、高蛋白飲食、缺乏運(yùn)動所導(dǎo)致的肥胖過程相似，小鼠在連續(xù)高脂飲食喂養(yǎng)并限制活動后，體重增加迅速，在第9周，與普通飲食組小鼠比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），說明本實(shí)驗(yàn)高脂飲食喂養(yǎng)可以成功誘導(dǎo)C57BL/6小鼠肥胖。本課題的前期研究結(jié)果顯示：高脂飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠血清胰島素水平升高，存在高胰島素血癥、胰島素抵抗[7]。本實(shí)驗(yàn)中小鼠存在肥胖和高胰島素血癥。

PAI-1是一種由脂肪組織合成和分泌的細(xì)胞因子[8]，主要滅活組織型纖溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，t-PA），作為纖溶活性的中心環(huán)節(jié)，PAI-1水平的升高將直接導(dǎo)致纖溶活性受損，與肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病及心血管疾病密切相關(guān)[9]。脂肪組織PAI-1基因的表達(dá)和PAI-1蛋白合成分泌增加。血漿PAI-1水平升高會激活血小板，促進(jìn)纖維蛋白的沉積并導(dǎo)致血栓形成，也能誘發(fā)動脈粥樣硬化斑塊的產(chǎn)生[6]。因此，血漿PAI-1水平與心血管疾病有著密切的關(guān)系。臨床研究發(fā)現(xiàn)肥胖患者大多伴隨有動脈粥樣硬化的癥狀，探討肥胖與動脈粥樣硬化之間的關(guān)系，建立兩者相關(guān)性的分子機(jī)制有很重要的意義。本研究顯示，高脂飲食造成的肥胖小鼠其內(nèi)臟和皮下來源脂肪細(xì)胞的PAI-1的表達(dá)均比正常小鼠升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明高脂飲食導(dǎo)致的肥胖小鼠有可能存在著高胰島素血癥，胰島素進(jìn)而誘導(dǎo)PAI-1的過表達(dá)，與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致[8-10]。早有研究表明，無論肥胖與否，腹部大網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞PAI-1的表達(dá)水平均高于皮下脂肪細(xì)胞[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高脂組內(nèi)臟脂肪細(xì)胞與皮下脂肪細(xì)胞表達(dá)PAI-1的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與內(nèi)臟肥胖更容易導(dǎo)致胰島素抵抗，與糖尿病等疾病的關(guān)系更為密切[11]報(bào)道相一致。

翼狀螺旋叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族的FOXC2和FOXO1在調(diào)控胰島素誘導(dǎo)的PAI-1表達(dá)方面發(fā)揮重要作用。其調(diào)控過程可歸納為：胰島素刺激FOXC2的表達(dá)，而激活的FOXC2通過結(jié)合到PAI-1啟動子的胰島素反應(yīng)原件（insulin response element，IRE）和鄰近Smad結(jié)合位點(diǎn)的叉頭框結(jié)合原件（foxhead-binding element，F(xiàn)BE）上調(diào)PAI-1表達(dá)，在此過程中可能涉及到TGF-β/Smad信號途徑[12]。FOXO1則通過抑制TGF-β/Smad信號途徑抑制PAI-1表達(dá)，但在高胰島素狀態(tài)下，由于PI3K/Akt信號通路激活使下游的FOXO1磷酸化而失活，使其失去抑制TGF-β誘導(dǎo)的PAI-1表達(dá)[13]；另一方面FOXO1可通過與FOXC2競爭IRE來拮抗FOXC2而調(diào)節(jié)PAI-1啟動子[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高脂小鼠的附睪周圍脂肪細(xì)胞表達(dá)的FOXC2高于皮下脂肪細(xì)胞，在胰島素作用后，兩種來源的脂肪細(xì)胞的FOXC2的表達(dá)均升高，附睪周圍脂肪細(xì)胞FOXC2的升高幅度更大，與胰島素作用前附睪周圍脂肪細(xì)胞對FOXC2的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。FOXO1在胰島素作用后，兩種來源的脂肪細(xì)胞的表達(dá)量均有所下降，附睪周圍脂肪細(xì)胞的表達(dá)量下降幅度更大，與胰島素作用前附睪周圍脂肪細(xì)胞FOXO1的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果可以說明，內(nèi)臟脂肪細(xì)胞對胰島素的反應(yīng)性更高，與外周型肥胖相比內(nèi)臟型肥胖更容易合成并表達(dá)PAI-1，也更容易患有糖尿病，心血管等脂類代謝異常的相關(guān)疾病。

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（收稿日期：2014-07-28 本文編輯：程 銘）

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（收稿日期：2014-07-28 本文編輯：程 銘）

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（收稿日期：2014-07-28 本文編輯：程 銘）