陳 鵬, 蘇境坦, 孔 瑋, 王洪鐘, 張貴友, 謝莉萍, 張榮慶

(清華大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 北京 100084)

生物礦化在生物界中廣泛存在, 也是貝類鈣代謝的重要內(nèi)容。生物礦化是生物有機(jī)體把溶液中的離子轉(zhuǎn)化成固體礦物的過(guò)程, 這個(gè)過(guò)程受到諸多因子的調(diào)控。TGFβ信號(hào)通路在脊椎動(dòng)物骨形成過(guò)程中發(fā)揮重要且復(fù)雜的調(diào)控作用[1-2], NF-кB信號(hào)通路除了免疫系統(tǒng), 也參與到脊椎動(dòng)物骨骼的穩(wěn)態(tài)維持系統(tǒng)之中[3], 而骨骼的生成維持是礦化過(guò)程的一個(gè)典型代表, 表明脊椎動(dòng)物中TGFβ和NF-кB信號(hào)通路與礦化有著緊密關(guān)系。在貝殼形成過(guò)程中, 基質(zhì)蛋白都被認(rèn)為發(fā)揮了重要作用[4-6]。合浦珠母貝(Pinctada fucata)中已被鑒定的基質(zhì)蛋白達(dá)數(shù)十種, 它們參與貝殼和珍珠形成的過(guò)程。因此, 研究貝中信號(hào)通路對(duì)基質(zhì)蛋白表達(dá)的調(diào)控作用, 對(duì)軟體動(dòng)物生物礦化分子機(jī)制的研究具有重要意義。

目前, 已從合浦珠母貝體內(nèi)克隆獲得多個(gè)TGFβ超家族成員, 如pf-Smad3、pf-ALR1等和NF-кB信號(hào)通路中的一些關(guān)鍵因子pf-IKK、poIκB以及pf-Rel[7-11]。周玉娟研究發(fā)現(xiàn)特異性抑制pf-Smad3的mRNA表達(dá)水平可導(dǎo)致基質(zhì)蛋白KRMP的mRNA表達(dá)水平顯著降低[12]。崔雨、王澤實(shí)等報(bào)導(dǎo)了核因子Pf-rel可以直接與基質(zhì)蛋白Nacrein的啟動(dòng)子相結(jié)合調(diào)控Nacrein的表達(dá), 而pf-IKK可以通過(guò)調(diào)節(jié)pf-Rel的入核來(lái)調(diào)控Nacrein的表達(dá)[13-14]。可以推測(cè), 在合浦珠母貝中,TGFβ和NF-кB信號(hào)通路也對(duì)礦化系統(tǒng)有著重要的調(diào)控功能。

在脊椎動(dòng)物中, DEX可以抑制TGFβ和NF-кB信號(hào)通路, 而H2O2可以激活這兩個(gè)信號(hào)通路[15-20]。本研究嘗試用這兩種藥物分別作用于合浦珠母貝, 通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TGFβ和NF-кB信號(hào)通路中關(guān)鍵因子pf-smad3、sox9、pif-BMP2、pf-rel、pf-IKK和基質(zhì)蛋白Nacrein、N19、N16、ACCBP的表達(dá)變化, 運(yùn)用掃描電鏡觀察貝殼珍珠層結(jié)構(gòu)的改變和利用體外碳酸鈣結(jié)晶實(shí)驗(yàn)研究間液蛋白對(duì)碳酸鈣晶體生長(zhǎng)的影響, 以期揭示TGFβ和NF-кB信號(hào)通路對(duì)貝礦化系統(tǒng)、尤其是珍珠層形成的調(diào)控功能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

合浦珠母貝(Pinctada fucata)取自廣西壯族自治區(qū)北海市國(guó)發(fā)珍珠養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

引物均合成于Invitrogen公司; 地塞米松購(gòu)于Whatman公司; 牛血清白蛋白(BSA)、H2O2購(gòu)于Sigma公司; SYBR Premix Ex Taq試劑盒購(gòu)于Takara公司; 其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)合浦珠母貝的藥物刺激

選取大小均勻的健康合浦珠母貝120只, 分成3組(各40只), 分別為DEX處理組、H2O2處理組以及生理鹽水處理對(duì)照組。用0.5 mm直徑注射器于每日下午固定時(shí)間分別注射4 μL藥物或生理鹽水至相應(yīng)組貝的閉殼肌中。連續(xù)注射14 d。DEX終濃度為10–7mol/L,H2O2終濃度為10–4mol/L, NaCl則與海水濃度一致。

藥物刺激3、7、14 d后, 分別提取健康個(gè)體間液蛋白、外套膜組織及貝殼作后續(xù)實(shí)驗(yàn)材料。

1.2.2 體外碳酸鈣結(jié)晶實(shí)驗(yàn)

參考方東的方法[21], 將飽和Ca(HCO3)2溶液, 與不同濃度的間液蛋白或BSA混合, 滴于硅化蓋玻片上, 每滴溶液為25 μL, 玻片旁放置50 μL 1 mol/L的NaOH溶液吸收CO2。封閉環(huán)境下室溫結(jié)晶24 h。

1.2.3 碳酸鈣結(jié)晶速率的測(cè)定

參考Suzuki的方法[22], 在96孔板中每孔依次加入100 μL 100 mmol/L 的 NaHCO3溶液、10 μL 4 μmol/L間液蛋白或BSA和100 μL 100 mmol/L 的CaCl2溶液, 通過(guò)分光光度計(jì)連續(xù)測(cè)定570 nm處吸光值, 每組重復(fù)5次。

1.2.4 掃描電鏡觀察

將貝殼珍珠層清水洗凈處理成小片, 然后在表面噴金。噴金60s后, 置于電鏡觀測(cè)臺(tái)正中, 標(biāo)記好方向, 于高真空模式下觀測(cè)。使用儀器為FEI Quanta 200掃描電鏡, 工作電壓為15 kV。

碳酸鈣晶型觀察采取類似的方法, 用無(wú)水酒精沖洗體外碳酸鈣結(jié)晶實(shí)驗(yàn)后的玻片, 清洗雜質(zhì), 之后晾干脫水。

1.2.5 拉曼光譜鑒定碳酸鈣晶型

分析使用RM2000光譜儀, 激光波長(zhǎng)為514 nm,掃描波長(zhǎng)范圍為100～1 200 cm–1, 功率為4.6 mW, 每個(gè)樣品重復(fù)掃描6～10次。

1.2.6 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

同周玉娟的方法[12]。

1.2.7 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR

實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的特異性引物設(shè)計(jì)見附件1。

采用 SYBR Green I 試劑盒(Takara)、Mx3000PTM RT-PCR System(Stratagene)。反應(yīng)體系和實(shí)驗(yàn)步驟同參考文獻(xiàn)[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 藥物刺激對(duì)貝殼珍珠層結(jié)構(gòu)的影響

利用掃描電鏡觀察貝殼珍珠層的結(jié)構(gòu)。正常的珍珠層由梯形排列的六邊形文石小片組成, 小片邊緣整齊清晰, 表面光滑平整(圖1C)。經(jīng)DEX處理后,珍珠層六邊形小片表面變得粗糙, 呈現(xiàn)散碎條帶狀(圖1D)。推測(cè)有可能是新形成的六邊形文石小片在生長(zhǎng)的過(guò)程中失去了 c-軸方向的嚴(yán)格調(diào)控。由于 c-軸方向的過(guò)度生長(zhǎng)致使文石小片的厚度增加。這與RNAi抑制Nacrein后所形成的珍珠層的結(jié)構(gòu)類似[23]。此外, 有些區(qū)域珍珠層文石有過(guò)度增生和紊亂覆蓋現(xiàn)象(圖1G、H、I), 可能是由于珍珠層文石片層生長(zhǎng)速度過(guò)快, 且失去精確調(diào)控, 從而導(dǎo)致珍珠層表面連成整片結(jié)構(gòu), 失去原有梯形生長(zhǎng)模式的結(jié)構(gòu)布局。

在H2O2處理組, 珍珠層中既有正常的文石小片,也有零碎的異常的文石小片(圖1J、K、L)。異常的文石小片無(wú)明顯的六邊形邊界, 呈碎片化, 但表面平整。它們可能是處于分解狀態(tài)而非合成狀態(tài)。

珍珠層與棱柱層的生長(zhǎng)過(guò)渡區(qū)的觀察顯示, 相比對(duì)照組(圖2A、B、C), DEX組珍珠層生長(zhǎng)前沿在有機(jī)基底膜(organic matrix, 圖2C、F、I短箭頭所示區(qū)域)上的生長(zhǎng)加快, 到達(dá)基底膜前沿(圖2D、E、F)。而 H2O2組珍珠層前沿出現(xiàn)孔隙和裂痕(圖2I), 前端生長(zhǎng)呈現(xiàn)停滯或減緩(圖2G、H)。初步推測(cè)DEX可加速珍珠層的生長(zhǎng), H2O2則可延緩珍珠層的生長(zhǎng)。

2.2 間液蛋白對(duì)體外碳酸鈣晶型的影響

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在體外模擬碳酸鈣結(jié)晶過(guò)程來(lái)檢測(cè)貝殼間液蛋白對(duì)碳酸鈣結(jié)晶的晶貌和晶型的作用,進(jìn)而對(duì)比不同實(shí)驗(yàn)組間液蛋白在碳酸鈣結(jié)晶的調(diào)控功能上的差異。

實(shí)驗(yàn)在方解石結(jié)晶體系中進(jìn)行, 分別加入不同濃度的經(jīng)DEX和H2O2處理14 d后提取的合浦珠母貝間液蛋白和 BSA。BSA對(duì)照組中, 結(jié)晶都為典型方解石形態(tài)。間液蛋白組生成晶體主要呈現(xiàn)兩種形態(tài), 一類為方晶形, 形態(tài)接近對(duì)照組, 邊緣有不同程度鈍化; 另一類呈啞鈴狀形態(tài)。

在光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計(jì)不同實(shí)驗(yàn)組所獲的碳酸鈣晶體的比例見表1。從中可以看出, 在相同的實(shí)驗(yàn)組,隨著加入間液蛋白濃度的升高, 結(jié)晶體系中的啞鈴形晶形比例呈升高趨勢(shì)。其中, DEX組促進(jìn)啞鈴形晶體生成的趨勢(shì)最強(qiáng), 對(duì)照組次之。進(jìn)一步利用拉曼光譜儀分析三種晶體的晶型, 結(jié)果表明, 方晶形晶體為方解石, 啞鈴狀晶體為文石(圖3)。

圖1 藥物刺激對(duì)貝殼珍珠層的影響Fig.1 The effect of DEX and H2O2 on nacre of shells

以上結(jié)果表明, 隨著間液蛋白濃度的升高, 碳酸鈣的結(jié)晶形態(tài)從方解石晶型向文石晶型轉(zhuǎn)變,DEX處理組間液蛋白加強(qiáng)了該趨勢(shì), H2O2處理組則減弱此趨勢(shì)。推測(cè)經(jīng)DEX處理后, 促進(jìn)文石生成的相關(guān)基質(zhì)蛋白的表達(dá)量提高或者抑制文石生成的相關(guān)基質(zhì)蛋白表達(dá)量降低, 使總體效果為加強(qiáng)文石的生成。H2O2處理組則總體效果相反。

2.3 間液蛋白對(duì)體外碳酸鈣結(jié)晶速率的影響

為了進(jìn)一步研究不同藥物處理組的間液蛋白在碳酸鈣結(jié)晶過(guò)程中的作用, 我們進(jìn)行了體外碳酸鈣結(jié)晶速率實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果顯示(圖4),與 BSA對(duì)照組相比, 加入間液蛋白的反應(yīng)體系在經(jīng)歷相同時(shí)間后, 570 nm的吸光度值(A570nm)都明顯升高, 而570 nm的吸光度值正反映了此時(shí)溶液中碳酸鈣晶體的多少, 這說(shuō)明間液蛋白能夠提高碳酸鈣晶體的生成速率。而在相同蛋白濃度下, DEX處理組間液蛋白對(duì)碳酸鈣結(jié)晶速率的促進(jìn)作用最強(qiáng), H2O2處理組比DEX處理組的促進(jìn)作用稍弱。

2.4 藥物刺激對(duì)信號(hào)通路和基質(zhì)蛋白表達(dá)水平的影響

外套膜為兩片位于貝殼內(nèi)側(cè), 包裹覆蓋整個(gè)軟體部的膜狀結(jié)構(gòu), 軟體動(dòng)物的貝殼是由外套膜分泌的物質(zhì)沉積而成[24]。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR, 檢測(cè)了藥物刺激下合浦珠母貝的外套膜組織中, TGFβ和NF-кB信號(hào)通路相關(guān)基因和珍珠層形成相關(guān)的基質(zhì)蛋白Nacrein、N19、N16、ACCBP的mRNA表達(dá)水平的變化, actin作為內(nèi)參。

表1 間液基質(zhì)蛋白濃度對(duì)體外碳酸鈣結(jié)晶的影響Tab.1 The effect of extrapallial fluid matrix protein on Calcium carbonate Crystallization in vitro

首先考察TGFβ信號(hào)通路和NF-кB信號(hào)通路相關(guān)基因的變化。結(jié)果(圖5)顯示, DEX處理組14 d樣品中, TGFβ信號(hào)通路的pf-Smad3、pif-BMP2、sox9表達(dá)水平下降約13%、13%、17%, NF-кB通路的pf-rel和 pf-IKK分別下降約 20%和 29%。H2O2處理組,Pf-Smad3, pif-BMP2, Sox9表達(dá)水平上升63%、71%、80%, pf-rel和 pf-IKK分別上升 25%和 14%。表明DEX 下調(diào) TGFβ和 NF-кB 信號(hào)通路表達(dá)水平, 而H2O2則上調(diào) TGFβ和 NF-кB信號(hào)通路表達(dá)水平, 并且TGFβ和NF-кB信號(hào)通路間表現(xiàn)出一致性變化。

與珍珠層礦化相關(guān)基質(zhì)蛋白表達(dá)水平的變化如圖6所示。Nacrein、N16、N19的總體表達(dá)水平在DEX 作用下都有所降低(圖6B、C、D), 而在 H2O2作用下明顯升高。pf-smad3、Nacrein、N19的變化趨勢(shì)存在著相對(duì)一致性(圖6A、B、C)。其中, Nacrein在珍珠層形成過(guò)程中能調(diào)節(jié)晶型和生長(zhǎng)速度, 抑制文石生成, N19能抑制碳酸鈣結(jié)晶。所以該結(jié)果有助于解釋2.1—2.3的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。而隨著時(shí)間變化顯示藥物的抑制和促進(jìn)效果都有減弱趨勢(shì), 這可能是因?yàn)樯矬w常見的適應(yīng)性調(diào)整。N16的變化(見圖6D、DEX組3 d稍上升, 7 d表達(dá)下降)滯后于pf-smad3, 考慮到N16的功能是誘導(dǎo)文石生成, 此處N16的下調(diào)可能是機(jī)體對(duì)于珍珠層生長(zhǎng)速度的拮抗性負(fù)調(diào)控。ACCBP能誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)化無(wú)定形碳酸鈣, 結(jié)果顯示, 在不同藥物處理和不同時(shí)間條件下都只有小的表達(dá)水平的波動(dòng)(圖6E), 不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著性, 推測(cè)ACCBP可能不受TGFβ和NF-кB信號(hào)通路的調(diào)控。

圖3 間液基質(zhì)蛋白調(diào)控體外碳酸鈣結(jié)晶Fig.3 Regulation of extrapallial fluid matrix protein on Calcium carbonate Crystallization in vitro

圖4 間液基質(zhì)蛋白對(duì)體外碳酸鈣結(jié)晶速率的影響Fig.4 The effect of extrapallial fluid matrix protein on crystalline velocity

以上結(jié)果有助于解釋藥物處理導(dǎo)致貝殼珍珠層的變化和間液蛋白功能的變化。DEX處理組珍珠層出現(xiàn)紊亂加速生長(zhǎng)和H2O2組生長(zhǎng)放緩可能是直接因?yàn)殚g液蛋白組分構(gòu)成發(fā)生變化。DEX處理組珍珠層生長(zhǎng)負(fù)調(diào)控蛋白Nacrein、N19和正調(diào)控蛋白N16表達(dá)都下降, 但是總體效果為促進(jìn)珍珠層的生長(zhǎng)。H2O2組Nacrein、N19和N16表達(dá)都上升, 總體效果為抑制珍珠層的生長(zhǎng)。同時(shí)基質(zhì)蛋白表達(dá)水平的變化影響間液中各蛋白組分相對(duì)濃度, 也影響到間液對(duì)碳酸鈣結(jié)晶的總體調(diào)控效果。

上述結(jié)果還顯示TGFβ和NF-кB信號(hào)通路表達(dá)水平變化的一致性, 且都與基質(zhì)蛋白的表達(dá)水平變化呈正相關(guān)。這提示TGFβ和 NF-кB信號(hào)通路可能協(xié)同作用調(diào)控礦化相關(guān)的基質(zhì)蛋白的表達(dá)。

2.5 DEX和 H2O2調(diào)控基質(zhì)蛋白表達(dá)的可能機(jī)制和意義

圖5 藥物刺激對(duì)TGFβ和NF-кB信號(hào)通路表達(dá)水平的影響Fig.5 The effect of drug treatment on TGFβ and NF-кB signaling pathways

圖6 藥物處理對(duì)基質(zhì)蛋白表達(dá)水平的影響Fig.6 The effect of drug treatment on expression level of matrix proteins

DEX和 H2O2對(duì)貝的信號(hào)通路作用的分子機(jī)制可能類似于脊椎動(dòng)物中的情況。在脊椎動(dòng)物體內(nèi),DEX活化糖皮質(zhì)激素受體(GR), 活化的 GR在胞內(nèi)直接作用于Smad3蛋白, 從而抑制TGFβ信號(hào)通路[15]。同時(shí), DEX還可以誘導(dǎo)NF-кB抑制因子IκBα的表達(dá),從而通過(guò)更多的IκBα結(jié)合NF-кB形成蛋白復(fù)合體抑制NF-кB的激活[16]。H2O2作為常見的活性氧簇(ROS),在動(dòng)物細(xì)胞中能引起氧化應(yīng)激反應(yīng), 直接激活TGFβ通路[17]。ROS也可促進(jìn)蛋白激酶C(PKC)的激活, 活化的PKC磷酸化IκB, 導(dǎo)致后者與NF-кB解離而使NF-кB活化[19-20], 從而影響下游基因的表達(dá)。

已有實(shí)驗(yàn)表明, 在合浦珠母貝體內(nèi)也存在這兩個(gè)信號(hào)通路, TGFβ信號(hào)通路可能通過(guò)下游Sox9等因子與基質(zhì)蛋白KRMP的啟動(dòng)子結(jié)合進(jìn)行調(diào)控[12]。NF-кB通路能通過(guò)核因子pf-rel直接與基質(zhì)蛋白Nacrein的啟動(dòng)子相結(jié)合進(jìn)行調(diào)控[13-14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果則表明,TGFβ和 NF-кB信號(hào)通路可能協(xié)同調(diào)控下游多個(gè)基質(zhì)蛋白。但是, 由于缺乏貝類細(xì)胞系, 細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)無(wú)法開展, DEX和H2O2在合浦珠母貝中具體的作用機(jī)制以及 TGFβ和NF-кB信號(hào)通路如何具體調(diào)控基質(zhì)蛋白還不明確, 仍需進(jìn)一步的研究。

自從白細(xì)胞介素-1(IL-1)被認(rèn)為是抗原刺激激活的免疫細(xì)胞分泌的可溶性因子, 同時(shí)也是激活破骨細(xì)胞的因子的現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)后[25], 不斷積累的證據(jù)證明, 脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)共享一些調(diào)節(jié)因子[26-27]。同時(shí), 脊椎動(dòng)物的骨骼與免疫系統(tǒng)在細(xì)胞起源、空間分布、功能及調(diào)控等方面存在許多相似性。由于貝殼和珍珠都是生物礦化的產(chǎn)物, 與骨骼有相似的形成機(jī)制。由此推測(cè), 免疫反應(yīng)與貝殼礦化之間可能也存在密切的關(guān)系。2004年, Mount 等[28]提出了“血細(xì)胞介導(dǎo)貝殼礦化”的新觀點(diǎn), 而貝類血淋巴細(xì)胞被認(rèn)為主要是履行天然免疫功能的, 暗示了貝殼的生物礦化可能與其免疫有關(guān)。

在脊椎動(dòng)物體內(nèi), NF-κB信號(hào)通路最重要也是研究最透徹的作用是參與到免疫系統(tǒng)的信號(hào)調(diào)控之中[29]。而TGFβ信號(hào)通路也在免疫反應(yīng)中起到重要作用, 炎癥初期能影響非特異性免疫[30]。熊訓(xùn)浩克隆了貝合浦珠母貝中NF-кB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因Pf-ALMP并證明該基因參與免疫應(yīng)答[31]?？梢酝茰y(cè)這兩個(gè)通路也參與貝的免疫反應(yīng)。而本次研究顯示這兩信號(hào)通路協(xié)同作用, 共同調(diào)控珍珠層基質(zhì)蛋白的表達(dá), 提示了貝的免疫體系可能和礦化系統(tǒng)存在高度的關(guān)聯(lián), 可能共用一些細(xì)胞信號(hào)通路, 或者礦化相關(guān)蛋白有部分直接為免疫相關(guān)信號(hào)通路下游所調(diào)控。

本次實(shí)驗(yàn)反映的珍珠層生長(zhǎng)與免疫相關(guān)信號(hào)通路的負(fù)相關(guān)性推測(cè), 說(shuō)明免疫系統(tǒng)的激活對(duì)于珍珠層的生長(zhǎng)可能是不利的。而尋找合適的免疫抑制劑,通過(guò)下調(diào)免疫系統(tǒng)的水平來(lái)提高養(yǎng)殖珍珠的生長(zhǎng)速度具有潛在的可行性。另外, 貝的免疫系統(tǒng)和礦化系統(tǒng)的交互調(diào)控可能具有重要的生物進(jìn)化學(xué)意義。兩個(gè)系統(tǒng)協(xié)同作用的機(jī)制有助于增強(qiáng)貝類對(duì)環(huán)境改變的適應(yīng)性。

3 結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)DEX和H2O2分別抑制或激活合浦珠母貝的TGFβ和NF-кB信號(hào)通路, 從而調(diào)控與珍珠層形成相關(guān)的基質(zhì)蛋白的表達(dá), 并影響珍珠層的結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示, DEX處理使得間液蛋白促進(jìn)珍珠層文石生成, 而H2O2處理則相反。實(shí)時(shí)定量PCR顯示, 藥物處理下TGFβ和NF-кB信號(hào)通路平行變化, 并且與基質(zhì)蛋白表達(dá)變化高度相關(guān)。推測(cè)基質(zhì)蛋白的表達(dá)可能同時(shí)受到這兩個(gè)信號(hào)通路的調(diào)控, 暗示免疫體系和礦化系統(tǒng)可能共用某些細(xì)胞信號(hào)通路, 兩個(gè)系統(tǒng)的協(xié)同作用機(jī)制具有重要的生物進(jìn)化學(xué)意義。本研究結(jié)果對(duì)于如何提高和控制養(yǎng)殖珍珠的產(chǎn)量和質(zhì)量也具有借鑒意義。

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