楊竹青，王自蕊，熊六鳳，阮記明，隗黎麗

(江西農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院，江西 南昌 330045)

金魚(Carassius auratus)堪稱中國國粹，起源于我國食用的普通野生鯽魚，經(jīng)過長期的環(huán)境和人工選擇形成了品種繁多、顏色多樣的觀賞魚類，受到了世界各國人們的喜愛。草金魚(Carassius auratus)，俗稱紅鯽或金鯽，是金魚中最古老的一種，即金魚的祖先，該品種抗病性和適應性強，體形和尾鰭與普通鯽魚相同，顏色有紅色、白色、紅白花色等。金魚的各種體色主要是由真皮層中許多色素細胞的色素沉積形成的，受遺傳、神經(jīng)內(nèi)分泌、年齡、營養(yǎng)、環(huán)境等因素影響，但其本質(zhì)是由遺傳因素控制的，研究表明魚類體色屬于高遺傳力的質(zhì)量性狀，通常受單個基因或少量幾個基因控制［1］。研究表明脊椎動物的顏色形成主要是由于黑色素細胞中的酪氨酸源性色素(即黑色素)沉積造成的，它能使魚類呈現(xiàn)黑色和褐色，有時也出現(xiàn)黃色［2-3］。黑色素合成過程主要受到黑素皮質(zhì)素受體1(Melanocortin Receptor 1，MC1R)α-MSH 配體信號通路(MC1R/α-MSH signaling pathway)和鼠灰色信號蛋白(agouti signaling protein，ASIP)α-MSH 配體信號通路(ASIP/α-MSH signaling pathway)等兩個信號通路調(diào)控［4-5］。

MC1R 基因是只含一個外顯子的單拷貝基因，編碼一個含7 個跨膜結構域的G 蛋白偶聯(lián)受體—黑素皮質(zhì)素受體1，在黑色素細胞中特異表達［6-7］。MC1R 與皮膚角質(zhì)細胞和黑色素細胞分泌的α 促黑色素細胞激素(α-melanocyte stimulate hormone，α-MSH)結合，活化腺苷酸環(huán)化酶(Adenylate cyclase)和蛋白激酶A(Protein kinase A)，再催化三磷酸腺苷(ATP)轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)腺苷單磷酸(Cyclic AMP，cAMP)。細胞內(nèi)cAMP 水平的上升能夠刺激黑色素體中限速酶—酪氨酸酶的活性，導致真黑色素的生成。此外cAMP 可通過粘附到細胞外的基質(zhì)蛋白，從而上調(diào)一些黑色素生成基因的表達［5，8］。大量研究表明MC1R 基因是影響人類、鳥類、畜禽、爬行以及魚類等許多動物體色的主效基因［5，9-10］。因此本研究選擇MC1R 基因作為影響金魚體色的功能候選基因，對其進行全長序列的擴增、SNP 搜尋及功能和進化研究，為魚類體色形成的分子機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

本研究所用實驗魚均購自江西省南昌市草金魚繁殖場。記錄每條魚的體色并收集尾鰭DNA 樣品，蛋白酶K 消化后采用常規(guī)的酚/氯仿提取。使用DU-640(Beckman，USA)測定DNA 濃度后，稀釋成20 ng/μL工作液，并在4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 引物的設計與合成 從NCBI 網(wǎng)站下載鯽魚MC1R 基因的DNA 序列(GenBank accesion No.AB618067.1)，使用在線引物設計軟件Primer 3.0(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)在MC1R 基因的保守區(qū)設計兩對引物用于PCR 擴增和SNP 搜尋，具體引物和退火溫度見表1。

表1 實驗研究所用的引物信息和擴增產(chǎn)物Tab.1 The PCR products and primers information in this study

1.2.2 草金魚MC1R 基因的PCR 擴增和克隆 為了更好擴增出MC1R 基因的全長序列，本實驗首先使用引物對F1/R2 擴增MC1R 基因的全長DNA 序列，然后使用引物對F1/R1和F2/R2進行半巢式PCR，得到更純更亮的PCR 擴增產(chǎn)物。PCR 反應體系為20 μL，其中基因組DNA 40 ng，1×PCR buffer，1.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，Taq DNA 聚合酶1.5 U(TAKARA)，0.25 μmol/L 上游引物和0.25 μmol/L下游引物。PCR 循環(huán)條件:94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35 個循環(huán);72 ℃延伸5 min。所有PCR 反應在PTC-200 熱循環(huán)儀(BIO-RAD，USA)上進行，PCR 產(chǎn)物送上海生工進行雙向測序。

1.2.3 MC1R 基因的SNP 搜尋 使用上述實驗條件和引物對，對野生銀鯽和白色草金魚的池DNA 進行PCR 擴增，割膠純化和雙向測序。將所得序列進行BLAST 分析，驗證其特異性，再分別用DNAStar 軟件包的Seqman 程序和Chromas Pro 軟件進行分析比較鑒別SNPs。

1.3 MC1R 基因的序列分析與系統(tǒng)進化樹的構建

測序結果經(jīng)過DNAStar 軟件包的Seqman 程序和Chromas Pro 軟件分析得到可信序列后，采用Cap3在線組裝軟件(http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php)進行序列的拼接;使用NCBI/ORF finder 在線軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)獲得MC1R 基因的ORF 框及氨基酸序列;通過SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?GENOMIC=1)軟件進行蛋白結構的預測和功能分析。使用NCBI/BLAST 和Cluster X 8.1 軟件進行同源序列搜索和同源性比對，并采用Mega4.1 軟件中的N.J 法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 草金魚MC1R 基因的PCR 擴增結果

MC1R 基因引物F1/R1擴增片段大小為887 bp，引物F2/R2擴增片段大小為806 bp，其片段大小與預期相符(圖1，圖2)。測序得到的金魚MC1R 基因序列與預期片段大小也一致，經(jīng)過DNAStar 軟件包的Seqman 程序和Chromas Pro 軟件分析得到可信序列后，采用Cap3 在線組裝軟件進行序列的拼接，拼接后得到1 316 bp 的全長序列。將所測序列與鯽魚MC1R 基因的mRNA 序列作BLAST 比較，發(fā)現(xiàn)這兩個片段的同源性均達99%以上，表明這兩個片段是金魚MC1R 基因所特異的序列標簽位點。

圖1 引物F1/R1的PCR 擴增結果Fig.1 Amplification results of MC1R using primers F1/R1

圖2 引物F2/R2的PCR 擴增結果Fig.2 Amplification results of MC1R using primers F2/R2

2.2 草金魚MC1R 基因SNP 搜尋及蛋白質(zhì)結構域分析

魚類MC1R 基因只有一個外顯子，通過對野生銀鯽魚和白色草金魚池DNA 擴增、測序，DNAstar 軟件分析發(fā)現(xiàn)在整個序列上只鑒定到1 個突變位點，即Exon 1 g.82 G＞A(圖3)。使用NCBI 在線ORF finder 分析發(fā)現(xiàn)該突變導致MC1R 基因的第28 個氨基酸發(fā)生改變(丙氨酸＞蘇氨酸)。通過SMART 軟件進行蛋白質(zhì)結構預測和功能分析，發(fā)現(xiàn)MC1R 蛋白有7 個跨膜蛋白組成(圖4)，且本研究檢測到第28個氨基酸的改變導致MC1R 蛋白形成了一個新的低復雜區(qū)(圖4，5)。

圖3 草金魚MC1R 基因的SNP 搜尋結果Fig.3 SNPs identification in MC1R gene of Carassius auratus

圖4 野生型MC1R 蛋白的保守結構域Fig.4 The protected structure domain of Wild MC1R protein

圖5 突變型MC1R 蛋白的保守結構域Fig.5 The protected structure domain of muture MC1R protein

2.3 MC1R 基因的同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構建

使用NCBI/BLAST 軟件進行MC1R 基因同源序列的搜索，獲得鯽魚(AB618067.1)、鯉魚(JX989223.1)、斑馬魚(AY161847.1)、虹鱒(NM_001195178.1)、墨西哥麗脂鯉(FJ665984.1)、條斑星鰈(AB287974.1)、牙鲆(AB661668.1)、莫桑比克羅非魚(AJ871147.1)、孔雀魚(AB563501.1)、花斑劍尾魚(DQ866828.1)、黑青斑河豚(AY332238.1)、紅鰭東方鲀(AY161854.1)等12 種魚類MC1R 基因的核苷酸序列。各種魚類MC1R 基因的cDS 序列大小有一定差異，其中莫桑比克羅非魚的編碼序列最長，而墨西哥麗脂鯉的編碼序列最短。同源性結果表明金魚MC1R 基因核甘酸序列與12 種魚類的同源性均很高，分別為99%，93%，86%，78%，78%，77%，77%，76%，75%，75%，75%，75%，這說明MC1R 基因在進化上非常保守，可用于物種進化分析。

利用Cluster X 8.1 對上述13 種核苷酸序列進行比對后，再用MEGA4.1 軟件進行系統(tǒng)進化樹的構建(圖6)。聚類結果與經(jīng)典分類學分類結果基本一致，13 種魚類MC1R 核酸序列明顯被聚為三類，同屬鯉科魚類的斑馬魚、鯉魚、金魚、鯽魚等聚為一類;其次是脂鯉科的墨西哥麗脂鯉單獨聚為一類;條斑星碟、牙鲆、莫桑比克羅非魚、黑青斑河豚、紅旗東方鲀、孔雀魚、花斑劍尾魚、虹鱒、墨西哥脂鯉聚為一類。結果表明在這13 種魚類中，鯽魚、鯉魚、斑馬魚和金魚最先遺傳分化出來，遺傳距離最近;與麗脂鯉、虹鱒、劍尾魚、孔雀魚的遺傳距離更遠。

圖6 13 種魚類MC1R 基因的系統(tǒng)進化樹(數(shù)值表示置信度)Fig.6 Phylogenetic tree of thirteen fishes in MC1R gene(values represent confidence level)

3 結論與討論

鑒于黑素皮質(zhì)素受體1(Melanocortin Receptor 1，MC1R)α-MSH 配體信號通路(MC1R/α-MSH signaling pathway)是調(diào)控動物黑色素合成的重要信號通路之一，在黑色素合成過程中起著開關作用，且該基因的突變導致很多物種的毛色和體色呈現(xiàn)多種顏色［1，9-10］，本研究將其選為草金魚色素沉積的功能候選基因。雖然已有研究表明MC1R 基因與魚類黑色素沉淀密切相關［9-11］，但到目前為止還沒有關于其與草金魚體色形成的相關性報道。本研究通過PCR 產(chǎn)物直接測序法搜尋了MC1R 基因在野生鯽魚和草金魚中的遺傳變異情況，在整個序列上只檢測到1 個SNP，這表明MC1R 基因是一個高度保守的基因，在不同物種間或物種內(nèi)只存在單個堿基的變異。進一步分析發(fā)現(xiàn)該突變導致MC1R 基因的第28個氨基酸發(fā)生改變(丙氨酸＞蘇氨酸)，且該突變導致MC1R 蛋白一個新的低復雜區(qū)形成，再次證明MC1R 基因在草金魚體色形成中起著重要的調(diào)控作用，有時單個堿基的改變就會導致受體激活或失活，引起魚類顏色的改變?nèi)绾谏?、金色、白色、花斑等?0，12］。MC1R 基因是墨西哥洞鯉和非洲齒鯉等魚類體色QTL 區(qū)域的重要功能候選基因之一，且該基因的單個堿基突變導致墨西哥洞鯉黑色素受體失去活性或活性降低，改變了黑色素細胞的大小、數(shù)量，最后造成黑色素形成受阻，從而使眼睛顏色呈現(xiàn)棕色隱性表型［9］，在孔雀魚中也得到了驗證［10］。然而Henning 等［13］研究發(fā)現(xiàn)MC1R 基因在麗魚金色表型中表達上調(diào)但沒有找到與麗魚金色表型相關的SNP。Tezuka 等［10］研究也發(fā)現(xiàn)該基因的SNP 與孔雀魚的黑斑顯著相關，但在不同群體中的等位基因效應不一樣，表明其遺傳效應可能還受到其他基因的修飾作用。以上矛盾結果可能是由于控制不同魚類黑色素沉積的作用機制或主效基因不同，同時可能由于魚類色素細胞種類和組合多樣等導致魚類體色判斷不準引起;也可能是由于基因間的互作如上位效應等對其產(chǎn)生重要作用;也許是由于所分析的樣品數(shù)相對較少，造成統(tǒng)計結果沒有達到顯著水平。

金魚因其五彩繽紛的體色總給人們帶來爽心悅目的感覺，一直被人類喜愛，與其他魚類相比，其受到強烈的環(huán)境和人工選擇。魚類的體色具有重要的觀賞和經(jīng)濟價值，是品種的標志，備受人們關注，相比其他性狀也受到更多的人工選擇。因此可以推測金魚在進化過程中，控制動物黑色素合成的重要基因(MC1R)也受到正向選擇作用。也有研究表明MC1R 基因是一個高度保守的基因，在遺傳進化中起著重要作用，可利用其核苷酸序列分析物種的進化關系［13-15］。本研究也發(fā)現(xiàn)13 種魚MC1R 基因的核苷酸序列的同源性均很高，且聚類結果與經(jīng)典分類結果一致。聚類結果表明鯽魚、鯉魚、斑馬魚和金魚最先遺傳分化出來，同屬鯉科魚類，遺傳距離最近;與麗脂鯉、虹鱒、劍尾魚、孔雀魚的遺傳距離更遠。胡建尊等［16］對甌江彩鯉MC1R 基因的系統(tǒng)進化樹分析也得到同樣的結果。因此MC1R 基因在金魚體色和進化的調(diào)控中起著重要調(diào)控作用，但其作用機制有待進一步研究。

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