楊竹青，王自蕊，熊六鳳，阮記明，隗黎麗

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045)

金魚(yú)(Carassius auratus)堪稱(chēng)中國(guó)國(guó)粹，起源于我國(guó)食用的普通野生鯽魚(yú)，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的環(huán)境和人工選擇形成了品種繁多、顏色多樣的觀賞魚(yú)類(lèi)，受到了世界各國(guó)人們的喜愛(ài)。草金魚(yú)(Carassius auratus)，俗稱(chēng)紅鯽或金鯽，是金魚(yú)中最古老的一種，即金魚(yú)的祖先，該品種抗病性和適應(yīng)性強(qiáng)，體形和尾鰭與普通鯽魚(yú)相同，顏色有紅色、白色、紅白花色等。金魚(yú)的各種體色主要是由真皮層中許多色素細(xì)胞的色素沉積形成的，受遺傳、神經(jīng)內(nèi)分泌、年齡、營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境等因素影響，但其本質(zhì)是由遺傳因素控制的，研究表明魚(yú)類(lèi)體色屬于高遺傳力的質(zhì)量性狀，通常受單個(gè)基因或少量幾個(gè)基因控制［1］。研究表明脊椎動(dòng)物的顏色形成主要是由于黑色素細(xì)胞中的酪氨酸源性色素(即黑色素)沉積造成的，它能使魚(yú)類(lèi)呈現(xiàn)黑色和褐色，有時(shí)也出現(xiàn)黃色［2-3］。黑色素合成過(guò)程主要受到黑素皮質(zhì)素受體1(Melanocortin Receptor 1，MC1R)α-MSH 配體信號(hào)通路(MC1R/α-MSH signaling pathway)和鼠灰色信號(hào)蛋白(agouti signaling protein，ASIP)α-MSH 配體信號(hào)通路(ASIP/α-MSH signaling pathway)等兩個(gè)信號(hào)通路調(diào)控［4-5］。

MC1R 基因是只含一個(gè)外顯子的單拷貝基因，編碼一個(gè)含7 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的G 蛋白偶聯(lián)受體—黑素皮質(zhì)素受體1，在黑色素細(xì)胞中特異表達(dá)［6-7］。MC1R 與皮膚角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞分泌的α 促黑色素細(xì)胞激素(α-melanocyte stimulate hormone，α-MSH)結(jié)合，活化腺苷酸環(huán)化酶(Adenylate cyclase)和蛋白激酶A(Protein kinase A)，再催化三磷酸腺苷(ATP)轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)腺苷單磷酸(Cyclic AMP，cAMP)。細(xì)胞內(nèi)cAMP 水平的上升能夠刺激黑色素體中限速酶—酪氨酸酶的活性，導(dǎo)致真黑色素的生成。此外cAMP 可通過(guò)粘附到細(xì)胞外的基質(zhì)蛋白，從而上調(diào)一些黑色素生成基因的表達(dá)［5，8］。大量研究表明MC1R 基因是影響人類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、畜禽、爬行以及魚(yú)類(lèi)等許多動(dòng)物體色的主效基因［5，9-10］。因此本研究選擇MC1R 基因作為影響金魚(yú)體色的功能候選基因，對(duì)其進(jìn)行全長(zhǎng)序列的擴(kuò)增、SNP 搜尋及功能和進(jìn)化研究，為魚(yú)類(lèi)體色形成的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用實(shí)驗(yàn)魚(yú)均購(gòu)自江西省南昌市草金魚(yú)繁殖場(chǎng)。記錄每條魚(yú)的體色并收集尾鰭DNA 樣品，蛋白酶K 消化后采用常規(guī)的酚/氯仿提取。使用DU-640(Beckman，USA)測(cè)定DNA 濃度后，稀釋成20 ng/μL工作液，并在4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 從NCBI 網(wǎng)站下載鯽魚(yú)MC1R 基因的DNA 序列(GenBank accesion No.AB618067.1)，使用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer 3.0(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)在MC1R 基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物用于PCR 擴(kuò)增和SNP 搜尋，具體引物和退火溫度見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)研究所用的引物信息和擴(kuò)增產(chǎn)物Tab.1 The PCR products and primers information in this study

1.2.2 草金魚(yú)MC1R 基因的PCR 擴(kuò)增和克隆 為了更好擴(kuò)增出MC1R 基因的全長(zhǎng)序列，本實(shí)驗(yàn)首先使用引物對(duì)F1/R2 擴(kuò)增MC1R 基因的全長(zhǎng)DNA 序列，然后使用引物對(duì)F1/R1和F2/R2進(jìn)行半巢式PCR，得到更純更亮的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR 反應(yīng)體系為20 μL，其中基因組DNA 40 ng，1×PCR buffer，1.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，Taq DNA 聚合酶1.5 U(TAKARA)，0.25 μmol/L 上游引物和0.25 μmol/L下游引物。PCR 循環(huán)條件:94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。所有PCR 反應(yīng)在PTC-200 熱循環(huán)儀(BIO-RAD，USA)上進(jìn)行，PCR 產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.3 MC1R 基因的SNP 搜尋 使用上述實(shí)驗(yàn)條件和引物對(duì)，對(duì)野生銀鯽和白色草金魚(yú)的池DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，割膠純化和雙向測(cè)序。將所得序列進(jìn)行BLAST 分析，驗(yàn)證其特異性，再分別用DNAStar 軟件包的Seqman 程序和Chromas Pro 軟件進(jìn)行分析比較鑒別SNPs。

1.3 MC1R 基因的序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)DNAStar 軟件包的Seqman 程序和Chromas Pro 軟件分析得到可信序列后，采用Cap3在線組裝軟件(http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php)進(jìn)行序列的拼接;使用NCBI/ORF finder 在線軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)獲得MC1R 基因的ORF 框及氨基酸序列;通過(guò)SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?GENOMIC=1)軟件進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和功能分析。使用NCBI/BLAST 和Cluster X 8.1 軟件進(jìn)行同源序列搜索和同源性比對(duì)，并采用Mega4.1 軟件中的N.J 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 草金魚(yú)MC1R 基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

MC1R 基因引物F1/R1擴(kuò)增片段大小為887 bp，引物F2/R2擴(kuò)增片段大小為806 bp，其片段大小與預(yù)期相符(圖1，圖2)。測(cè)序得到的金魚(yú)MC1R 基因序列與預(yù)期片段大小也一致，經(jīng)過(guò)DNAStar 軟件包的Seqman 程序和Chromas Pro 軟件分析得到可信序列后，采用Cap3 在線組裝軟件進(jìn)行序列的拼接，拼接后得到1 316 bp 的全長(zhǎng)序列。將所測(cè)序列與鯽魚(yú)MC1R 基因的mRNA 序列作BLAST 比較，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)片段的同源性均達(dá)99%以上，表明這兩個(gè)片段是金魚(yú)MC1R 基因所特異的序列標(biāo)簽位點(diǎn)。

圖1 引物F1/R1的PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of MC1R using primers F1/R1

圖2 引物F2/R2的PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of MC1R using primers F2/R2

2.2 草金魚(yú)MC1R 基因SNP 搜尋及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析

魚(yú)類(lèi)MC1R 基因只有一個(gè)外顯子，通過(guò)對(duì)野生銀鯽魚(yú)和白色草金魚(yú)池DNA 擴(kuò)增、測(cè)序，DNAstar 軟件分析發(fā)現(xiàn)在整個(gè)序列上只鑒定到1 個(gè)突變位點(diǎn)，即Exon 1 g.82 G＞A(圖3)。使用NCBI 在線ORF finder 分析發(fā)現(xiàn)該突變導(dǎo)致MC1R 基因的第28 個(gè)氨基酸發(fā)生改變(丙氨酸＞蘇氨酸)。通過(guò)SMART 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和功能分析，發(fā)現(xiàn)MC1R 蛋白有7 個(gè)跨膜蛋白組成(圖4)，且本研究檢測(cè)到第28個(gè)氨基酸的改變導(dǎo)致MC1R 蛋白形成了一個(gè)新的低復(fù)雜區(qū)(圖4，5)。

圖3 草金魚(yú)MC1R 基因的SNP 搜尋結(jié)果Fig.3 SNPs identification in MC1R gene of Carassius auratus

圖4 野生型MC1R 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.4 The protected structure domain of Wild MC1R protein

圖5 突變型MC1R 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.5 The protected structure domain of muture MC1R protein

2.3 MC1R 基因的同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

使用NCBI/BLAST 軟件進(jìn)行MC1R 基因同源序列的搜索，獲得鯽魚(yú)(AB618067.1)、鯉魚(yú)(JX989223.1)、斑馬魚(yú)(AY161847.1)、虹鱒(NM_001195178.1)、墨西哥麗脂鯉(FJ665984.1)、條斑星鰈(AB287974.1)、牙鲆(AB661668.1)、莫桑比克羅非魚(yú)(AJ871147.1)、孔雀魚(yú)(AB563501.1)、花斑劍尾魚(yú)(DQ866828.1)、黑青斑河豚(AY332238.1)、紅鰭東方鲀(AY161854.1)等12 種魚(yú)類(lèi)MC1R 基因的核苷酸序列。各種魚(yú)類(lèi)MC1R 基因的cDS 序列大小有一定差異，其中莫桑比克羅非魚(yú)的編碼序列最長(zhǎng)，而墨西哥麗脂鯉的編碼序列最短。同源性結(jié)果表明金魚(yú)MC1R 基因核甘酸序列與12 種魚(yú)類(lèi)的同源性均很高，分別為99%，93%，86%，78%，78%，77%，77%，76%，75%，75%，75%，75%，這說(shuō)明MC1R 基因在進(jìn)化上非常保守，可用于物種進(jìn)化分析。

利用Cluster X 8.1 對(duì)上述13 種核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)后，再用MEGA4.1 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建(圖6)。聚類(lèi)結(jié)果與經(jīng)典分類(lèi)學(xué)分類(lèi)結(jié)果基本一致，13 種魚(yú)類(lèi)MC1R 核酸序列明顯被聚為三類(lèi)，同屬鯉科魚(yú)類(lèi)的斑馬魚(yú)、鯉魚(yú)、金魚(yú)、鯽魚(yú)等聚為一類(lèi);其次是脂鯉科的墨西哥麗脂鯉單獨(dú)聚為一類(lèi);條斑星碟、牙鲆、莫桑比克羅非魚(yú)、黑青斑河豚、紅旗東方鲀、孔雀魚(yú)、花斑劍尾魚(yú)、虹鱒、墨西哥脂鯉聚為一類(lèi)。結(jié)果表明在這13 種魚(yú)類(lèi)中，鯽魚(yú)、鯉魚(yú)、斑馬魚(yú)和金魚(yú)最先遺傳分化出來(lái)，遺傳距離最近;與麗脂鯉、虹鱒、劍尾魚(yú)、孔雀魚(yú)的遺傳距離更遠(yuǎn)。

圖6 13 種魚(yú)類(lèi)MC1R 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(數(shù)值表示置信度)Fig.6 Phylogenetic tree of thirteen fishes in MC1R gene(values represent confidence level)

3 結(jié)論與討論

鑒于黑素皮質(zhì)素受體1(Melanocortin Receptor 1，MC1R)α-MSH 配體信號(hào)通路(MC1R/α-MSH signaling pathway)是調(diào)控動(dòng)物黑色素合成的重要信號(hào)通路之一，在黑色素合成過(guò)程中起著開(kāi)關(guān)作用，且該基因的突變導(dǎo)致很多物種的毛色和體色呈現(xiàn)多種顏色［1，9-10］，本研究將其選為草金魚(yú)色素沉積的功能候選基因。雖然已有研究表明MC1R 基因與魚(yú)類(lèi)黑色素沉淀密切相關(guān)［9-11］，但到目前為止還沒(méi)有關(guān)于其與草金魚(yú)體色形成的相關(guān)性報(bào)道。本研究通過(guò)PCR 產(chǎn)物直接測(cè)序法搜尋了MC1R 基因在野生鯽魚(yú)和草金魚(yú)中的遺傳變異情況，在整個(gè)序列上只檢測(cè)到1 個(gè)SNP，這表明MC1R 基因是一個(gè)高度保守的基因，在不同物種間或物種內(nèi)只存在單個(gè)堿基的變異。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)該突變導(dǎo)致MC1R 基因的第28個(gè)氨基酸發(fā)生改變(丙氨酸＞蘇氨酸)，且該突變導(dǎo)致MC1R 蛋白一個(gè)新的低復(fù)雜區(qū)形成，再次證明MC1R 基因在草金魚(yú)體色形成中起著重要的調(diào)控作用，有時(shí)單個(gè)堿基的改變就會(huì)導(dǎo)致受體激活或失活，引起魚(yú)類(lèi)顏色的改變?nèi)绾谏?、金色、白色、花斑等?0，12］。MC1R 基因是墨西哥洞鯉和非洲齒鯉等魚(yú)類(lèi)體色QTL 區(qū)域的重要功能候選基因之一，且該基因的單個(gè)堿基突變導(dǎo)致墨西哥洞鯉黑色素受體失去活性或活性降低，改變了黑色素細(xì)胞的大小、數(shù)量，最后造成黑色素形成受阻，從而使眼睛顏色呈現(xiàn)棕色隱性表型［9］，在孔雀魚(yú)中也得到了驗(yàn)證［10］。然而Henning 等［13］研究發(fā)現(xiàn)MC1R 基因在麗魚(yú)金色表型中表達(dá)上調(diào)但沒(méi)有找到與麗魚(yú)金色表型相關(guān)的SNP。Tezuka 等［10］研究也發(fā)現(xiàn)該基因的SNP 與孔雀魚(yú)的黑斑顯著相關(guān)，但在不同群體中的等位基因效應(yīng)不一樣，表明其遺傳效應(yīng)可能還受到其他基因的修飾作用。以上矛盾結(jié)果可能是由于控制不同魚(yú)類(lèi)黑色素沉積的作用機(jī)制或主效基因不同，同時(shí)可能由于魚(yú)類(lèi)色素細(xì)胞種類(lèi)和組合多樣等導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)體色判斷不準(zhǔn)引起;也可能是由于基因間的互作如上位效應(yīng)等對(duì)其產(chǎn)生重要作用;也許是由于所分析的樣品數(shù)相對(duì)較少，造成統(tǒng)計(jì)結(jié)果沒(méi)有達(dá)到顯著水平。

金魚(yú)因其五彩繽紛的體色總給人們帶來(lái)爽心悅目的感覺(jué)，一直被人類(lèi)喜愛(ài)，與其他魚(yú)類(lèi)相比，其受到強(qiáng)烈的環(huán)境和人工選擇。魚(yú)類(lèi)的體色具有重要的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是品種的標(biāo)志，備受人們關(guān)注，相比其他性狀也受到更多的人工選擇。因此可以推測(cè)金魚(yú)在進(jìn)化過(guò)程中，控制動(dòng)物黑色素合成的重要基因(MC1R)也受到正向選擇作用。也有研究表明MC1R 基因是一個(gè)高度保守的基因，在遺傳進(jìn)化中起著重要作用，可利用其核苷酸序列分析物種的進(jìn)化關(guān)系［13-15］。本研究也發(fā)現(xiàn)13 種魚(yú)MC1R 基因的核苷酸序列的同源性均很高，且聚類(lèi)結(jié)果與經(jīng)典分類(lèi)結(jié)果一致。聚類(lèi)結(jié)果表明鯽魚(yú)、鯉魚(yú)、斑馬魚(yú)和金魚(yú)最先遺傳分化出來(lái)，同屬鯉科魚(yú)類(lèi)，遺傳距離最近;與麗脂鯉、虹鱒、劍尾魚(yú)、孔雀魚(yú)的遺傳距離更遠(yuǎn)。胡建尊等［16］對(duì)甌江彩鯉MC1R 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析也得到同樣的結(jié)果。因此MC1R 基因在金魚(yú)體色和進(jìn)化的調(diào)控中起著重要調(diào)控作用，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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