洪 晨,邢 奕,2*,司艷曉,2,李 洋 (.北京科技大學(xué)土木與環(huán)境工程學(xué)院,北京 00083；2.北京科技大學(xué)金屬礦山高效開采與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 00083)

鐵礦區(qū)內(nèi)重金屬對(duì)土壤氨氧化微生物群落組成的影響

洪 晨1,邢 奕1,2*,司艷曉1,2,李 洋1(1.北京科技大學(xué)土木與環(huán)境工程學(xué)院,北京 100083；2.北京科技大學(xué)金屬礦山高效開采與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100083)

以密云水庫(kù)上游某鐵礦區(qū)為研究對(duì)象,采用熒光定量PCR和變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析了礦區(qū)內(nèi)不同采樣點(diǎn)的土壤中氨氧化微生物的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的變化,結(jié)果表明,土樣中氨氧化細(xì)菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)的數(shù)量變化范圍分別為 3.01×107～1.08×109copies/g干土和 8.65×107～2.69×109copies/g干土.重金屬含量與氨氧化微生物數(shù)量的相關(guān)性分析以及氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)的冗余分析結(jié)果表明,該礦區(qū)內(nèi)重金屬污染改變了土壤中的氨氧化微生物的數(shù)量和結(jié)構(gòu).Cu污染對(duì)AOA的數(shù)量起到了顯著抑制作用(r= -0.653*, P<0.05),但是對(duì)AOB則沒(méi)有明顯作用;Zn污染對(duì)尾礦庫(kù)區(qū)域土壤的AOA/AOB比值影響顯著(r= -0.606*, P<0.05);Cd污染改變了AOB的種群分布,降低了AOB的多樣性水平.土壤中Cr長(zhǎng)期干擾并沒(méi)有改變氨氧化微生物的數(shù)量和結(jié)構(gòu),但是明顯得抑制了氨氧化速率,表明重金屬污染在一定程度上也影響了土壤生態(tài)系統(tǒng)的氮循環(huán).

鐵礦區(qū)；氨氧化古菌(AOA)；氨氧化細(xì)菌(AOB)；DGGE；real-time PCR

金屬礦山開采和選冶活動(dòng)會(huì)造成礦區(qū)及其周邊土壤環(huán)境中重金屬的累積,累積在土壤中的重金屬元素在地表徑流和生物地球化學(xué)作用下還會(huì)發(fā)生遷移,進(jìn)入到周圍的大氣、水和土壤環(huán)境中,通過(guò)直接呼吸及食物鏈長(zhǎng)期危害人體健康[1-2].土壤微生物對(duì)重金屬的脅迫要比同一環(huán)境中的動(dòng)物和植物敏感得多,多種終點(diǎn)指標(biāo)可以被用來(lái)指示重金屬對(duì)土壤微生物群落的效應(yīng),如土壤生物量、土壤呼吸、酶活性、硝化作用和固氮等.其中,硝化作用是對(duì)重金屬脅迫最敏感的土壤微生物過(guò)程之一[3].另外,硝化作用是土壤氮素轉(zhuǎn)化的重要過(guò)程,不僅關(guān)系到銨態(tài)氮在土壤中的轉(zhuǎn)化,而且與過(guò)量氮肥投入導(dǎo)致的土壤酸化、硝酸鹽淋失及其引起的水體污染和溫室氣體(N2O)[4]釋放等一系列生態(tài)環(huán)境問(wèn)題直接相關(guān).

一直以來(lái),氨氧化細(xì)菌(AOB)被認(rèn)為是自養(yǎng)氨氧化過(guò)程的最重要貢獻(xiàn)者.然而,泉古菌門中的化能自養(yǎng)氨氧化古菌(AOA)的發(fā)現(xiàn),將氨氧化微生物由細(xì)菌域推進(jìn)到古菌域[5].有研究表明在高氮投入的中性和堿性的環(huán)境中,AOB是硝化作用的主要驅(qū)動(dòng)者,而AOA主要在較苛刻的環(huán)境包括低氮、強(qiáng)酸性和高溫的環(huán)境中發(fā)揮功能活性[6-8].然而也有學(xué)者認(rèn)為,一般農(nóng)田土壤和草地土壤中主導(dǎo)氨氧化過(guò)程的是 AOB而不是 AOA[9-10].因此,AOA和AOB對(duì)自養(yǎng)硝化過(guò)程的相對(duì)貢獻(xiàn)仍是爭(zhēng)論的熱點(diǎn).各種研究顯示,復(fù)雜自然環(huán)境下不同的理化性質(zhì)驅(qū)使AOA和AOB產(chǎn)生不同的反應(yīng),從而在氮循環(huán)中占據(jù)各自的生態(tài)位[8].

在氨氧化過(guò)程中,氨氧化細(xì)菌和古菌都有由amoA基因編碼的氨單加氧酶(AMO),其α亞基能催化NH3到NH2OH[11].因此,amoA基因是目前用來(lái)研究陸地和水體生態(tài)系統(tǒng)中氨氧化微生物的主要途徑.然而,采用分子生物學(xué)手段研究土壤硝化微生物功能種群的演變還處于起步階段,大部分研究圍繞著土壤理化性質(zhì)如pH值、溫度、水分、底物濃度及不同土壤類型、土地利用類型[12-18]對(duì)氨氧化微生物的影響,對(duì)自然土壤中重金屬長(zhǎng)期干擾下土壤氨氧化功能基因的變化規(guī)律[19]則研究較少.

本研究以密云水庫(kù)上游鐵礦區(qū)為例,采集了礦區(qū)內(nèi)重金屬污染下的土壤樣品,分別測(cè)定其氨氧化勢(shì)(PAO),通過(guò)熒光定量 PCR和變性梯度凝膠電泳(DGGE)研究amoA基因的豐度和多樣性,得到該區(qū)域內(nèi)群落組成變化與硝化作用的關(guān)聯(lián),并在環(huán)境因子與氨氧化群落之間的復(fù)雜關(guān)系中找到重金屬對(duì)氨氧化微生物起到的作用,為進(jìn)一步了解重金屬在氮循環(huán)中起到的作用提供基礎(chǔ)信息.

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 樣品采集及處理

研究區(qū)為北京市密云縣北部山區(qū)某鐵礦區(qū),位于密云水庫(kù)上游 10km以內(nèi),礦區(qū)緊挨潮河,該地區(qū)富含鐵礦資源,采礦歷史有 30年之久,采礦活動(dòng)頻繁.以尾礦庫(kù)為中心,礦區(qū)內(nèi)尾礦庫(kù)周圍5km的范圍內(nèi),根據(jù)村落的分布,在每一個(gè)村落周圍采集不同土地利用類型(人工林、莊稼地)的表層土壤共10個(gè)點(diǎn),在尾礦庫(kù)區(qū)域采集荒漠地表層土壤共4個(gè)點(diǎn),如圖1所示.在每個(gè)采樣點(diǎn)的不同位置按Z字型分別采樣4次,然后混合均勻作為一個(gè)樣品,并詳細(xì)記錄采樣點(diǎn)環(huán)境狀況,所有樣品保存在密封的塑料封口袋中.一部分土樣立刻放入-20℃冰凍箱中保存用作分子學(xué)實(shí)驗(yàn).另一部分經(jīng)風(fēng)干、研磨、過(guò)篩后,供土壤理化性質(zhì)、重金屬含量測(cè)定,所有土壤置于4 ℃保存?zhèn)溆?

1.2 土壤理化性質(zhì)及重金屬含量測(cè)定

土壤基本理化性質(zhì)采用常規(guī)方法測(cè)定.pH值測(cè)定(水土比為 2.5:1)采用 pH 計(jì)(Starter-3C,OHAUS,USA).采用 CHNS/O (Perkin-Elmer,USA)元素分析儀測(cè)定土壤有機(jī)碳、全氮含量.有效磷采用鉬銻抗比色法測(cè)定.土壤中重金屬總量根據(jù)國(guó)家地質(zhì)實(shí)驗(yàn)測(cè)試中心標(biāo)準(zhǔn)(Q/GD001-2002)土壤中微量元素的密閉溶樣-電感耦合等離子質(zhì)譜法測(cè)定.銨態(tài)氮采用2mol/L KCl浸提后靛酚藍(lán)比色法測(cè)定其含量.硝態(tài)氮含量采用雙波長(zhǎng)法測(cè)定

圖1 研究區(qū)域及采樣點(diǎn)分布Fig.1 The study area and sampling sites location

1.3 土壤潛在氨氧化勢(shì)(PAO)測(cè)定

根據(jù)Kurola等[20]的方法,取5g鮮土于50mL離心管中,PBS緩沖液(g/L:NaCl,8.0;KCl,0.2;Na2HP04,0.2;NaH2P04,0.2;pH7.4)和 5mol/L(NH4)2SO4溶液各50mL(此時(shí)溶液中氨氮濃度為70mg/L),加入 1mL 1g/L的亞硝氮氧化抑制劑KClO3(終濃度為 10mg/L),培養(yǎng)后加入 5mL 2mol/LKCI提取-N,離心后用重氮化偶合分光光度法測(cè)定提取液中-N 濃度,以mg-N/(kg干土·h)表示土壤硝化勢(shì).

1.4 熒光定量PCR

土壤總DNA采用美國(guó)MoBio公司的土壤微生物強(qiáng)力提取試劑盒提取.提取的 DNA純化后置于-20℃儲(chǔ)存.氨氧化細(xì)菌和古菌的熒光定量PCR擴(kuò)增采用特異引物(表 1).于 ABI Prism 7500Real-time PCR system擴(kuò)增儀上進(jìn)行絕對(duì)定量PCR分析.每個(gè)樣品 3次重復(fù),熒光定量 PCR反應(yīng)體系 20μL,每個(gè)體系包括:10μL AB qPCR Master Mix (AB gene),正向和反向引物(10mmol/L)各 1.0μL,牛 血 清 白 蛋 白 1μL(10mmol/L),超純水7μL,DNA模板1μL.反應(yīng)體系為:94℃ 15min;94℃ 15s,變性溫度(表 1)1min,72℃ 34s,共40個(gè)循環(huán).根據(jù)He等[21]報(bào)道記載方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,以提取的混合 DNA為模板進(jìn)行氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌的amoA基因的 PCR擴(kuò)增,將PCR產(chǎn)物切膠純化后,ρMD l8-T載體連接PCR產(chǎn)物,以大腸桿菌DH5α制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物,在氨芐青霉素平板上進(jìn)行藍(lán)白斑試驗(yàn)篩選陽(yáng)性克隆.取部分陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌液進(jìn)行測(cè)序.重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果經(jīng) GenBank的 Blast比對(duì),分別與細(xì)菌和泉古菌 amoA基因同源性達(dá)99%.表明重組質(zhì)粒可以作為氨氧化微生物進(jìn)行絕對(duì)熒光定量 PCR分析的標(biāo)準(zhǔn) DNA.提取重組質(zhì)粒 DNA,用 Nanodrop(美國(guó))測(cè)定重組質(zhì)粒DNA的質(zhì)量濃度,分別計(jì)算 amoA基因拷貝數(shù),其中氨氧化細(xì)菌為 8.58×1010copies/μL,氨氧化古菌為4.8×1010copies/μL.以10倍梯度分別稀釋重組質(zhì)粒,使得 DNA濃度范圍在 100～10-4ng.通過(guò)熒光定量PCR擴(kuò)增分別獲得細(xì)菌、古菌的基因amoA標(biāo)準(zhǔn)曲線.其中Ct與基因拷貝數(shù)之間存在明顯的線性關(guān)系(r2>0.99,擴(kuò)增效率在90%～105%之間).由標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得出未知樣品細(xì)菌和古菌的amoA基因拷貝數(shù).每g干土的基因拷貝數(shù)分別代表了AOB和AOA的豐度.AOA/AOB為氨氧化古菌和氨氧化細(xì)菌的豐度的比值,是研究自養(yǎng)硝化微生物相對(duì)貢獻(xiàn)率的一個(gè)重要指標(biāo).

表1 PCR擴(kuò)增引物及反應(yīng)條件Table 1 PCR amplification primers and reaction conditions

1.5 變性梯度凝膠電泳( PCR-DGGE)

應(yīng)用表 1中所示引物對(duì)提取的礦區(qū)土壤總DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增,引物及PCR反應(yīng)條件如表1所示.GC夾(CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGC GGGGCGGGGGCACGGGGG G)分別加到正向引物前面,以保證DGGE實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定和片斷的分離.25μL PCR反應(yīng)體系組成如下:2×PCR預(yù)混液12.5μL,去離子水 9μL,DNA 模板 0.5μL,正向引物和反向引物(10mmol/L,上海生工)各 0.5μL.氨氧化細(xì)菌PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min;94℃變性 30s,55℃退火 30s,72℃延伸 40s,共 35個(gè)循環(huán),72℃最終延伸 10min,4℃保溫.氨氧化古菌PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性 5min;94℃變性30s,53℃退火 30s,72℃延伸 50s,共 35個(gè)循環(huán),72℃最終延伸10min,4℃保溫.獲得PCR產(chǎn)物后,取部分反應(yīng)混合物用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).變性梯度凝膠的制備使用北京君意公司變性梯度凝膠電泳系統(tǒng).變性梯度范圍如表1所示,聚丙烯酰胺凝膠濃度是8%.在 1×TAE電泳緩沖液中,100V 的電壓下,60℃電泳 10h.電泳結(jié)束后,采用 1:10000SYBR 染色 30min后,用 Red?Personal Imaging System(ProteinSimple, Santa Clara, CA, USA)成像和拍照.DGGE圖譜中DNA條帶由凝膠成像系統(tǒng)分析軟件 Quantity One(version 4.6.7)識(shí)別和統(tǒng)計(jì),確定各個(gè)樣品電泳條帶的多少,亮度峰值.

1.6 數(shù)據(jù)分析

以細(xì)菌種群在每一泳道中亮度峰面積的百分含量為重要值構(gòu)造細(xì)菌矩陣,為降低稀有種群對(duì)排序的影響,用于排序的種群要同時(shí)滿足該種群在各樣點(diǎn)出現(xiàn)的頻度≥2和該種群在至少一個(gè)樣點(diǎn)的相對(duì)豐度≥1%的要求.為消除量綱不同對(duì)數(shù)據(jù)分析的干擾,對(duì)環(huán)境因子進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和中心化處理,對(duì)種群信息進(jìn)行中心化處理.使用 Canoco(version 4.5,Biometrics-Plant Research International,The Netherlands)軟件對(duì)土壤理化性質(zhì)、重金屬以及數(shù)據(jù)化后的種群信息進(jìn)行冗余分析(RDA),得到微生物種群變化的主要解釋因子.采用 Monte Carlo permutation檢驗(yàn)2種RDA排序軸特征值的顯著性,置換次數(shù)均為 499次.土壤理化性質(zhì)(含水率、pH值、有效磷、有機(jī)碳、全氮、、)、重金屬含量和細(xì)菌、真菌、放線菌的數(shù)量變化的相關(guān)性采用SPSS(SPSSlnc., Chicago, 1L)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤基本理化性質(zhì)和重金屬含量分析

如表 2所示,土壤 pH值的變化范圍在7.2～7.8之間,這和以往北京郊區(qū)土壤的pH值測(cè)定范圍(7.0～8.2)一致.研究區(qū)域土壤的含水率在7.59%～25.59%內(nèi),以荒草地的含水率值最低,而且有機(jī)碳(1.26～5.81g/kg)、全氮量(0.29～0.70g/kg)和有效磷(1.26～5.81mg/kg)也是在荒草地取得最低值.其它來(lái)自農(nóng)田和林地的采樣點(diǎn)有機(jī)碳、全氮及有效磷含量均比荒草地要高,這可能與農(nóng)田長(zhǎng)期施用N-P-K復(fù)合肥有關(guān),可能是因?yàn)殚L(zhǎng)期施用化學(xué)肥料能提高難氧化有機(jī)質(zhì)含量,增加土壤有機(jī)碳的氧化穩(wěn)定性,從而增加土壤中碳氮含量[24],另外人工林地表覆蓋了大量植被殘落物,經(jīng)過(guò)微生物的分解及緩慢的腐解過(guò)程,轉(zhuǎn)化為腐殖質(zhì),增加土壤中的碳氮儲(chǔ)量.

表2 土壤基本理化性質(zhì)Table 2 Physico–chemical characteristics of soil samples

表3中可以看到,礦區(qū)內(nèi)Cr、Cd平均含量超出北京市土壤背景值4～5倍[25],Cu、Zn超過(guò)土壤背景值約2倍,其他重金屬(Pb、Ni、Co等)并未超出該地區(qū)土壤背景值(未在表 3中顯示).就全國(guó)土壤背景值(國(guó)家土壤環(huán)境質(zhì)量一級(jí)標(biāo)準(zhǔn))而言[26],Cr、Cu、Cd平均含量均超過(guò)一級(jí)標(biāo)準(zhǔn),其中 Cd的平均含量超過(guò)土壤一級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 2～3倍,而Zn平均含量則未超過(guò)一級(jí)標(biāo)準(zhǔn).以我國(guó)土壤環(huán)境質(zhì)量一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)作為重金屬污染評(píng)價(jià)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[26],計(jì)算了 14個(gè)采樣點(diǎn)的內(nèi)梅羅綜合污染指數(shù),結(jié)果表明,尾礦庫(kù)周圍(T1、T2、T3、T4)的 Cd含量均值達(dá) 0.68mg/kg,超過(guò)一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(0.2mg/kg)3倍以上,是造成該區(qū)域中度污染的主要元素.礦區(qū)內(nèi)其它采樣點(diǎn)(S5～S14)均屬于輕度污染區(qū)域.該礦區(qū)內(nèi)由于長(zhǎng)期進(jìn)行露天采礦及在選礦過(guò)程中篩分、破碎礦石,產(chǎn)生了大量含有重金屬元素的工業(yè)粉塵,在風(fēng)力作用下擴(kuò)散、沉降;另外開采過(guò)程中產(chǎn)生的剝離礦以及選礦后產(chǎn)生的尾礦,有效利用率低,長(zhǎng)期在地表堆積,在地表徑流、風(fēng)力、雨水淋溶的作用下,重金屬組分不斷地?cái)U(kuò)散遷移.這些因素均導(dǎo)致重金屬大量進(jìn)入到周圍土壤環(huán)境中,使該礦區(qū)內(nèi)土壤環(huán)境受到一定程度的污染.

表3 土壤重金屬含量Table 3 The metal content of soil samples

2.2 氨氧化勢(shì)及amoA基因豐度變化

對(duì)不同采樣點(diǎn)的氨氧化勢(shì)和 amoA基因拷貝數(shù)進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如圖2、3顯示.氨氧化勢(shì)即為將氧化成的能力,可以代表土壤中的硝化作用.由圖2可以看到,以尾礦庫(kù)周圍的采樣點(diǎn) T1、T2氨氧化速率最低,分別為 0.005,0.001mg/(kg·h),并且可以明顯看到,尾礦庫(kù)周圍土壤的氨氧化速率普遍較低,均值為 0.020mg/(kg·h).氨氧化速率較高的采樣點(diǎn)為 S10、S8,分別為 0.213, 0.171mg/(kg·h).

圖2 不同采樣點(diǎn)氨氧化勢(shì)變化Fig.2 Changes in potential for ammonia oxidation of different sampling sites

圖3 不同采樣點(diǎn)amoA基因豐度變化Fig.3 Changes in amoA gene copies of different sampling sites

由圖 3得出,AOA基因拷貝數(shù)為每克干土8.65×107～2.69×109copies,最大值出現(xiàn)在 S9 采樣點(diǎn).AOB基因拷貝數(shù)為每克干土3.01×107～1.08×109copies,最大值在點(diǎn) S10取得,兩者均是在采樣點(diǎn) T2處達(dá)到最低值.所有采樣點(diǎn)土壤中,AOA豐度都比AOB高,AOA/AOB比率在1.21～8.69之間.

2.3 土壤理化性質(zhì)、重金屬對(duì) amoA、PAO的影響

由表 4可以看到,有效磷、有機(jī)碳、全氮、硝酸鹽都與氨氧化勢(shì)有顯著的相關(guān)性(P<0.05).由此可知,土壤理化性質(zhì)是影響氨氧化作用的重要因素,這在很多研究中都已得到證實(shí)[12,15].C、N、P等為硝化微生物的機(jī)體構(gòu)建提供必需元素,而且氮作為硝化作用的基質(zhì),因此土壤 C、N等的有效性均對(duì)硝化作用具有重要影響.土壤硝態(tài)氮含量高低是表征土壤硝化作用強(qiáng)弱的重要參數(shù),土壤中硝態(tài)氮含量越高,說(shuō)明其具有越強(qiáng)的硝化潛力[12,15].AOA和AOB的數(shù)量與氨氧化勢(shì)都有顯著的相關(guān)性(r=0.642,P<0.01;r=0.541,P<0.05),其中以AOA的相關(guān)性更強(qiáng).說(shuō)明AOA在該區(qū)域的氨氧化微生物群落生態(tài)功能中占據(jù)更重要的地位.

表4 土壤理化性質(zhì)與amoA、氨氧化勢(shì)的相關(guān)性Table 4 The correlation between soil physico–chemical characteristics and amoA abundance and potential for ammonia oxidation

有機(jī)碳、有效磷、全氮都在不同程度上影響了氨氧化細(xì)菌和古菌的豐度(P<0.05),并進(jìn)而影響了氨氧化作用.因此,在區(qū)域范圍內(nèi),理化性質(zhì)的區(qū)別是影響AOA、AOB豐度的重要原因.這與Yao等[12]和Kelly等[27]通過(guò)對(duì)土壤采樣點(diǎn)中影響氨氧化微生物群落的多個(gè)環(huán)境因子進(jìn)行分析,得到pH值、氮的基質(zhì)濃度和磷含量是最主要的影響因子的結(jié)果相一致.賀紀(jì)正等[8]對(duì)我國(guó)典型土壤中這 2類氨氧化微生物的分布特征的研究中也發(fā)現(xiàn),在區(qū)域尺度上,AOA和AOB的數(shù)量與土壤有機(jī)質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系,這可能是因?yàn)橛袡C(jī)質(zhì)含量影響了土壤有機(jī)氮的礦化程度,從而影響了氨氧化微生物利用NH4+的效率.

在控制土壤理化性質(zhì)的線性影響的條件下,對(duì)重金屬、氨氧化勢(shì)、氨氧化微生物進(jìn)行偏相關(guān)分析,如表5所示.

由表5可以看到,Cu與AOA的數(shù)量有著顯著的負(fù)相關(guān)性(r= -0.653*, P<0.05),AOA/AOB的比值與Zn存在顯著的負(fù)相關(guān)(r= -0.606*, P<0.05),說(shuō)明Zn長(zhǎng)期污染對(duì)AOA和AOB產(chǎn)生了不同的影響.Cd與氨氧化微生物的數(shù)量并沒(méi)有顯著相關(guān)性.Cr對(duì)氨氧化過(guò)程起著顯著的抑制作用,但是Cr與AOB、AOA均并未發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)性,說(shuō)明了 Cr可能是通過(guò)其他途徑來(lái)改變氨氧化作用.

表5 重金屬與amoA、氨氧化勢(shì)的相關(guān)性Table 5 The correlation between metal content and amoA abundance and potential for ammonia oxidation

2.4 氨氧化微生物群落DGGE圖譜分析

AOA、AOB的DGGE圖譜如圖4所示,AOB的多樣性除去在T1、T2、T3取得較低值外,其他采樣點(diǎn)的多樣性均在1.81～2.23,條帶數(shù)在7～12之間;而AOA的多樣性的最低值在S6處,多樣性在0.65～1.75之間,條帶數(shù)在2～8條.可以看到,在該礦區(qū)內(nèi)AOB的種群多樣性明顯比AOA豐富.

通過(guò)SPSS分析氨氧化勢(shì)和氨氧化微生物多樣性指數(shù)的相關(guān)性表明,氨氧化勢(shì)與AOA、AOB種類都沒(méi)有顯著相關(guān).

圖4 礦區(qū)內(nèi)不同采樣點(diǎn)的氨氧化細(xì)菌DGGE圖譜Fig.4 AOB (a)and AOA (b)DGGE fingerprint from different samples in iron area

2.5 環(huán)境因子對(duì)氨氧化微生物種群結(jié)構(gòu)變化的影響

采用冗余分析(RDA)對(duì)影響氨氧化群落種群分布的環(huán)境因子進(jìn)行了分析,結(jié)果表明,通過(guò)Monte Carlo permutation檢驗(yàn),所有排序軸均顯著(P<0.01),說(shuō)明排序效果理想.AOB的RDA的前兩軸分別代表了種群 31.7%、16.0%的變異,對(duì)應(yīng)了34.3%、17.3%的氨氧化細(xì)菌種群與環(huán)境因子之間關(guān)系.第 1排序軸僅與有著顯著相關(guān)性(P<0.01),說(shuō)明第1軸主要反映了的變化,即從左到右含量逐漸升高.從圖5a中可以明顯看到,種群富集在含量高的地方,僅有少數(shù)種群分布在含量低的地方.第2排序軸與Cd、有機(jī)碳、全氮、有效磷、含水率呈顯著相關(guān)性(P<0.05),說(shuō)明第2軸主要反映了Cd、有機(jī)碳等指標(biāo)的變化,沿著第2軸從下到上,Cd含量逐漸下降,而其他指標(biāo)逐漸升高.根據(jù)大部分種群的多分布在第2軸上方可以得出Cd對(duì)種群分布存在著抑制作用.

圖5 冗余度(RDA)分析環(huán)境因素對(duì)土壤中氨氧化細(xì)菌(a)及古菌(b)群落結(jié)構(gòu)變化的影響Fig.5 Redunancy discrimination analysis relating environmental variables to the community structure of AOB (a)and AOA (b)in iron area

對(duì)AOA種群信息的RDA分析表明,AOA的前2軸分別代表種群56.5%、13.7%的變異,對(duì)應(yīng)60.0%、14.6%的氨氧化古菌種群與環(huán)境因子之間關(guān)系.第1排序軸同樣僅與NH4+呈顯著相關(guān)性(P<0.01),第2排序軸與含水率呈較顯著相關(guān)性(P<0.05).說(shuō)明AOA的種群分布僅受土壤理化性質(zhì)的影響,長(zhǎng)期污染重金屬并未對(duì) AOA的分布起到明顯的抑制作用.

3 討論

3.1 AOA、AOB的豐度和多樣性水平

該區(qū)域內(nèi)AOA和AOB的豐度變化范圍較大,但是均在肥力水平較低、污染最重的尾礦庫(kù)周圍區(qū)域達(dá)到最低值,其 AOB基因豐度為3.01×107～2.19×108copies/g干土,AOA 基因豐度為 8.65×107～9.23×108copies/g 干土,分別比相同pH 及肥力水平的土壤[28]AOA 豐度(1.54×107～4.25×107copies/g干土)提高了2～20倍,比AOB的豐度(1.24×105～2.79×106copies/g 干土)提高了近200倍,AOA/AOB比值明顯降低.而采自礦區(qū)內(nèi)其他土壤如農(nóng)田、林地的AOA和AOB與相同肥力水平的農(nóng)田土壤[29]相比,均提高了 10倍左右,AOA/AOB比值范圍在 1.21～7.35之間,與Wessen[29]的研究相差不多.因此,重金屬污染可能影響了尾礦庫(kù)區(qū)域土壤的 AOA/AOB比值,表5結(jié)果表明,Zn與AOA/AOB的負(fù)相關(guān)性顯著(r=-0.606*,P<0.05),這種現(xiàn)象與其他研究者[19,30-31]的研究一致,Mertens等觀察了AOA和AOB在長(zhǎng)期Zn污染下的數(shù)量、mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化,顯示AOB和AOA在面對(duì)土壤Zn污染時(shí),AOB表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗性.

從圖 4可以看出,AOB的群落結(jié)構(gòu)變化比AOA明顯得多,說(shuō)明AOB更容易受到外界環(huán)境的影響,比如土壤理化性質(zhì)、外來(lái)重金屬污染等.Shen等[28]的研究也表明,堿性土壤中長(zhǎng)期施肥處理對(duì)AOB的數(shù)量及組成有明顯影響,而對(duì)AOA的影響較小.

3.2 重金屬對(duì)氨氧化微生物群落豐度和多樣性的影響

將氨氧化微生物群落豐度、多樣性水平的變化進(jìn)行分析,結(jié)果表明,該礦區(qū)內(nèi)重金屬污染對(duì)AOA、AOB的豐度以及AOB的種群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定影響(表 5、圖 5).比如 Cu對(duì)氨氧化古菌的數(shù)量起到了顯著抑制作用(r= -0.653*,P<0.05),但是對(duì)氨氧化細(xì)菌則沒(méi)有明顯作用.Cd污染降低了AOB的多樣性水平卻沒(méi)有改變AOB的數(shù)量,并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Cd污染對(duì)AOA有顯著影響.產(chǎn)生這些結(jié)果的可能原因是氨氧化古菌和氨氧化細(xì)菌在生理學(xué)上存在著根本區(qū)別,許多研究表明,在系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化方面,AOA形成了一類完全獨(dú)立于AOB的進(jìn)化分支,而且AOA的生理代謝機(jī)制與AOB不完全相同,AOA既可進(jìn)行自養(yǎng)代謝,也可以通過(guò)混合營(yíng)養(yǎng)方式生活[32].有研究認(rèn)為氨氧化古菌的能量代謝依賴于含有Cu而非Fe的電子傳遞系統(tǒng)[33],這可能會(huì)影響氨氧化菌對(duì)重金屬Cu的敏感性.Cd顯著影響了AOB的種群多樣性,但是并沒(méi)有改變AOB的數(shù)量.可能因?yàn)锳OB中某些種群對(duì) Cd污染產(chǎn)生了抗性機(jī)制,其他種群受到抑制數(shù)量減少以致消失,而這些具有抗性的種群由于適應(yīng)了污染環(huán)境,數(shù)量反而增多.

土壤中Cr長(zhǎng)期干擾并沒(méi)有改變氨氧化微生物的數(shù)量和結(jié)構(gòu),但是明顯得抑制了氨氧化速率(r= -0.607*, P<0.05).Cr抑制氨氧化速率的可能途徑為Cr進(jìn)入細(xì)胞后,對(duì)編碼氨單加氧酶的核糖核酸(amoA mRNA)的合成、轉(zhuǎn)錄過(guò)程起到抑制作用,從而導(dǎo)致功能酶的濃度下降逐步影響到硝化反應(yīng)的速率[34].

3.3 AOA和AOB對(duì)土壤自養(yǎng)硝化過(guò)程的相對(duì)貢獻(xiàn)率

AOA和 AOB對(duì)土壤自養(yǎng)硝化過(guò)程的相對(duì)貢獻(xiàn)率是目前氮循環(huán)研究關(guān)鍵的微生物生態(tài)學(xué)問(wèn)題之一[17].氨氧化微生物與氨氧化勢(shì)的相關(guān)性(表 4)表明,AOA 在該區(qū)域氨氧化過(guò)程中占據(jù)了主要地位.有效磷、有機(jī)碳、全氮與AOA和AOB的相關(guān)性都比較顯著(P<0.05),但是含水率和銨態(tài)氮與AOB有著顯著相關(guān)性(P<0.05),而與AOA則沒(méi)有相關(guān),說(shuō)明AOB相比AOA更容易受到含水率和銨態(tài)氮的影響,這也從另一方面證明了AOA比AOB更適應(yīng)干旱、低氮的環(huán)境,許多研究也得出了這個(gè)結(jié)論[12,15],這就解釋了荒草地中AOA為何在氨氧化過(guò)程中占據(jù)主要生態(tài)位.本研究還發(fā)現(xiàn),在礦區(qū)內(nèi)的農(nóng)田和林地土壤中也是AOA主導(dǎo)氨氧化過(guò)程,這與一些研究結(jié)果 AOB在農(nóng)田、草地土壤的氨氧化過(guò)程中起主要作用相反[9],但是有些學(xué)者則認(rèn)為[27],AOA具有廣泛的新陳代謝能力,能利用有機(jī)碳進(jìn)行兼養(yǎng)和異養(yǎng),因此可以在含碳量豐富的土壤中廣泛分布.該研究中 AOA與有機(jī)碳的相關(guān)性比 AOB更顯著(r=0.810**, P<0.01; r=0.532*, P<0.05),也給出了AOA在農(nóng)田、林地土壤中不僅數(shù)量豐富也占據(jù)著更重要的生態(tài)位的原因.本研究還發(fā)現(xiàn),雖然Cu、Zn對(duì) AOA產(chǎn)生了一定的抑制作用(表 4),但是并沒(méi)有改變AOA在硝化過(guò)程中的主導(dǎo)地位,說(shuō)明低濃度的重金屬并不足以改變 AOA和AOB生態(tài)位.

該區(qū)域內(nèi)長(zhǎng)期重金屬Cu、Zn、Cd的輕度污染改變了AOA、AOB的豐度和種群結(jié)構(gòu),但是并沒(méi)有改變AOA和AOB在硝化過(guò)程中的生態(tài)位.盡管土壤的氨氧化作用在很大程度上取決于土壤的理化性質(zhì),但是Cr與氨氧化勢(shì)的顯著相關(guān)性表明,重金屬在一定程度上也影響了土壤生態(tài)系統(tǒng)的氮循環(huán).因此,該地區(qū)的重金屬污染應(yīng)該引起有關(guān)部門重視,加強(qiáng)生態(tài)環(huán)境保護(hù).

4 結(jié)論

4.1 AOA在該區(qū)域內(nèi)氨氧化微生物的氮循環(huán)生態(tài)功能中占據(jù)更重要地位,重金屬污染對(duì)AOA的抑制作用也沒(méi)有改變AOA的主導(dǎo)地位.

4.2 重金屬污染對(duì)氨氧化微生物的影響表現(xiàn)為,Cu對(duì) AOA的數(shù)量起到了顯著抑制作用(r=-0.653*, P<0.05),但是對(duì) AOB則沒(méi)有明顯作用.Cd污染降低了AOB的多樣性水平卻沒(méi)有改變AOB的數(shù)量.Cd污染對(duì)AOA沒(méi)有顯著影響.

4.3 重金屬污染對(duì)氨氧化作用的影響表現(xiàn)為,Cr并沒(méi)有改變氨氧化微生物的數(shù)量和結(jié)構(gòu),但是明顯的抑制了氨氧化速率(r= -0.607*,P<0.05).

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Impact of long-term heavy metals pollution on ammonia oxidizing microbial community in an iron mine soil.

HONG Chen1, XING Yi1,2*, SI Yan-xiao1,2, LI Yang1(1.Civil and Environmental Engineering School, University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083, China；2.Key Laboratory of High Efficiency Mining and Safety for Metal Mine, Ministry of Education, University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083, China). China Environmental Science, 2014,34(5)：1212～1221

To examine the changes of ammonia-oxidizing microorganisms community in an iron mine of the upstream area of Miyun Reservoir, soil samples were collected from fourteen sites. Quantification of ammonia-oxidizing bacteria(AOB)and archaea (AOA)were performed by real-time PCR, and the microbial community structures were studied by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). The results showed that the copy numbers per gram of dry soil of AOB changed from 3.01×107to 1.08×109and the copy numbers per gram of dry soil of AOA varied from 8.65×107to 2.69×109.Pearson correlation and the redundancy analysis results showed that heavy metal pollution had changed the abundance and community structure of soil ammonia-oxidizing microorganisms in this iron area. The Cu pollution had a significant inhibitory effect on abundance of AOA (r = -0.653*, P < 0.05), but had no effect on AOB; The Zn pollution had a remarkable effect on AOA/AOB ratio of tailing area (r= -0.606*, P<0.05); Cd pollution changed the AOB community structure and reduced its diversity; The long-term interference of Cr did not change the abundance and community structure of soil ammonia oxidizing microorganisms, but inhibited the ammonia oxidation rate obviously. The results showed that heavy metal pollution affect the circulation of nitrogen in soil ecosystem to a certain extent.

iron metal；archaea (AOA)；ammonia-oxidizing bacteria (AOB)；DGGE；real-time PCR

X53

A

1000-6923(2014)05-1212-10

2013-08-27

國(guó)家自然科學(xué)基金(41273091);北京市科技新星計(jì)劃(Z111106054511043)

* 責(zé)任作者, 副教授, xingyi@ustb.edu.cn

洪 晨(1984-),男,河北三河人,北京科技大學(xué)博士研究生,研究方向?yàn)槲勰嗝撍苫⒌V區(qū)土壤修復(fù)研究.發(fā)表論文17篇.