劉聯(lián)杰，周安盛，方聰明，王常高+林建國+杜馨+蔡俊

摘要：以菊糖芽孢乳桿菌（Sporolactobacillus inulinus）為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線、硫酸二乙酯的誘變處理，采用碳酸鈣平板初篩及搖瓶復(fù)篩得到1株高產(chǎn)D-乳酸的正向突變株D11。通過單因素試驗研究D11菌株發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的條件。結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵溫度37 ℃，初始pH 6.5，轉(zhuǎn)速160 r/min，接種量5%，裝液量50 mL/250 mL，發(fā)酵68 h，該菌株D-乳酸產(chǎn)量達到56.18 g/L，比出發(fā)菌種提高49.53%。

關(guān)鍵詞： 菊糖芽孢乳桿菌（Sporolactobacillus inulinus）;D-乳酸;誘變育種;正向突變

中圖分類號：Q935 ? ? ? ?文獻標(biāo)識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）20-4936-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.043

Mutation Breeding and Optimization of Fermentation for Producing D-lactic Acid

with Sporolactobacillus inulinus

LIU Lian-jie， ZHOU An-sheng， FANG Cong-ming， WANG Chang-gao， LIN Jian-guo， DU Xin， CAI Jun

（Key Laboratory of Fermentation Engineering of Ministry of Education/Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation， Hubei University of Technology， Wuhan 430068， China）

Abstract： After the original strain Sporolactiobacillus inulinus was mutated by UV and DES and selected by CaCO3 plates， a D-lactic acid yield positive mutant D11 by fermenting in shake flask was obtained. Through the single factor experiment， the fermentation conditions of producing D-lactic acid was studied. The results showed that the D-lactic acid production reached 56.18g/L when the fermentation temperature was 37 ℃，initial pH was 6.5， the rotation speed was 160 rpm/min， inoculums was 5%（V/V）， liquid volume was 50 mL/250 mL， fermentation time 68 h. The D-lactic acid production reached 56.18 g/L and was enhanced by 49.53% compared with original strain.

Key words： Sporolactobacillus inulinus; D-lactic acid; mutation breeding; forward mutation

乳酸是自然界最小的手性分子，具有L（+）和D（-）兩種光學(xué)構(gòu)型。D-乳酸作為一個手性中心，是合成多種手性物質(zhì)的前體，在醫(yī)藥、農(nóng)藥、化工等方面的應(yīng)用十分廣泛。與L-乳酸繁榮的研究景象相比，D-乳酸的開發(fā)略顯單薄[1]。異構(gòu)體之一的D-乳酸是一種重要的手性中間體和生物可降解聚乳酸材料合成的原料。近年來石油資源的日益減少以及人們環(huán)保意識的提高，極大地促進了通過發(fā)酵法合成D-乳酸的需求量，同時要求對其生產(chǎn)菌種的發(fā)酵性能進行改造。研究者們利用誘變育種策略顯著提高了乳酸菌的D-乳酸產(chǎn)量[2]。

微生物誘變育種技術(shù)可選育出產(chǎn)量高、性狀優(yōu)良的突變株。通過發(fā)酵條件優(yōu)化可確定微生物高效合成產(chǎn)物的最適環(huán)境[3]。目前，通過誘變選育獲得高產(chǎn)D-乳酸的工作已有一些報道，如：用甲基磺酸乙酯（EMS）對野生型Lactobacillus delbrueckii ATCC 9649 菌株進行誘變，突變菌株DP3利用復(fù)雜培養(yǎng)基乳酸產(chǎn)量可達117 g/L，比出發(fā)菌種提高了75%，且具有更高的乳酸耐受能力、生長速率和轉(zhuǎn)化率[4，5]。用氮離子束對芽孢乳桿菌（Sporolactobacillus）進行誘變，突變菌株Y2-8的D-乳酸產(chǎn)量達122 g/L，比出發(fā)菌株提高了2倍。于培星[6]以凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）JD-063D為出發(fā)菌株，采用紫外線、硫酸二乙酯、鈷60γ-射線輻照、微波進行復(fù)合誘變，得到正突變菌株，進行發(fā)酵檢測和遺傳穩(wěn)定性試驗，最終篩選出一株JD-76D，該菌株產(chǎn)酸由出發(fā)茵株的61 g/L提高到145 g/L，D-乳酸純度由原菌株的97.5%增加到98.7%以上。

本試驗以紫外線和硫酸二乙酯誘變處理的方法，對菊糖芽孢乳桿菌（Sporolactobacillus inulinus）的選育及誘變后的最適發(fā)酵條件（發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、初始pH、搖床轉(zhuǎn)速、接種量、裝液量等）進行了研究。

1 ?材料與方法

1.1 ?菌種

菊糖芽孢乳桿菌（Sporolactobacillus inulinus），本實驗室保藏。

1.2 ?培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母抽提物0.5%，葡萄糖2%，檸檬酸銨0.2%，磷酸氫二鉀0.2%，乙酸鈉0.5%，吐溫80 0.1%，硫酸鎂0.02%，硫酸錳0.005%， 瓊脂2%，115 ℃滅菌30 min，pH 6.2～6.5。

種子培養(yǎng)基（液體MRS）：蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母抽提物0.5%，葡萄糖 2%，檸檬酸銨0.2%，磷酸氫二鉀0.2%，乙酸鈉0.5%，吐溫80 0.1%，硫酸鎂0.02%，硫酸錳0.005%，115 ℃滅菌30 min，pH 6.2～6.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，酵母抽提物0.5%，葡萄糖10%，磷酸氫二鉀0.2%，乙酸鈉0.3%，硫酸鎂0.01%，發(fā)酵前一次性添加碳酸鈣5%，115 ℃滅菌30 min，pH 6.5。

碳酸鈣初篩平板培養(yǎng)基：在上述斜面培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入碳酸鈣5%。

1.3 ?誘變方法

1.3.1 ?細胞懸浮液的制備 ?取活化后的斜面菌種一環(huán)，接入50 mL種子培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h后，取10 mL轉(zhuǎn)入100 mL種子培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取10 mL該培養(yǎng)液，8 000 r/min離心10 min，收集菌體，菌體用10 mL生理鹽水離心洗滌2次，用玻璃珠振蕩分散，然后將菌體充分懸浮于10 mL生理鹽水中。使細胞濃度為l08 個/mL，細胞懸浮液的濃度采用平板計數(shù)法測定。

1.3.2 ?紫外線處理 ?紫外致死率曲線的制作：分別取1 mL菌懸液于無菌培養(yǎng)皿中，置于紫外燈下30 cm處，開啟15 W紫外燈，預(yù)熱20 min，在磁力攪拌下，打開皿蓋，分別照射0、5、10、15、20、25、30、35、40、45 s，然后取不同時間誘變處理的0.5 mL菌液進行適當(dāng)稀釋后，涂布于碳酸鈣初篩平板上，37 ℃避光培養(yǎng)48 h，計算每皿菌落數(shù)。計算致死率并繪制曲線。

致死率=（A-B）/A×100%（A為對照組平皿上的菌落數(shù)，B為不同時間誘變處理后平皿上的菌落數(shù)）

選擇致死率為70%～80%的處理時間作為最佳誘變時間[7]，并在此時間下進行紫外線誘變處理。

1.3.3 ?硫酸二乙酯（DES）誘變 ?取硫酸二乙酯原液5 mL，加入到5 mL無水乙醇搖勻溶解，將經(jīng)紫外誘變得到的誘變菌株制備菌懸液與硫酸二乙酯溶液混勻，自加入硫酸二乙酯溶液后開始計時，在37 ℃、160 r/min的搖床內(nèi)振蕩反應(yīng)，處理一定時間后加入硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)，并涂布于碳酸鈣初篩平板上，37 ℃避光培養(yǎng)48 h，計算每皿的菌落數(shù)。計算致死率（計算方法同紫外誘變）并繪制曲線。

1.4 ?誘變菌株的篩選

1.4.1 ?初篩 ?將經(jīng)過誘變處理的菌液涂布于碳酸鈣初篩平板上，37 ℃避光培養(yǎng)48 h后，觀察變色圈的大小，測定變色圈直徑和菌落直徑之比（即HC值），挑選HC值大的菌株保藏。

1.4.2 復(fù)篩

1）種子液制備。取初篩獲得的菌株一環(huán)接入50 mL種子培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h后，取10 mL轉(zhuǎn)入100 mL種子培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h即得。

2）發(fā)酵復(fù)篩。將上述種子液以5%的接種量轉(zhuǎn)入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，37 ℃搖床發(fā)酵培養(yǎng)72 h，測定其D-乳酸含量，選取產(chǎn)量高的菌株保存。

3）遺傳穩(wěn)定性試驗。選取誘變后得到D-乳酸含量較高的變異菌株連續(xù)傳代7次，測定D-乳酸含量。

1.5 ?分析方法

1.5.1 ?D-乳酸含量的測定 ?采用高效液相色譜法，色譜分離柱：Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）; 檢測器：紫外檢測器;波長：210 nm;流速：0.5 mL/min;柱溫：35 ℃;流動相：0.2 mmol的硫酸銅。

1.5.2 ?總酸含量的測定 ?采用EDTA定鈣滴定法[8]。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?出發(fā)菌株生長曲線

出發(fā)菌株菊糖芽孢乳桿菌在MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)的生長曲線見圖1。從圖1可看出，該菌株的對數(shù)生長期為16～28 h，根據(jù)此對數(shù)生長期，選取培養(yǎng)時間為24 h的細胞作為誘變用細胞。

2.2 ?菊糖芽孢乳桿菌的誘變

2.2.1 ?紫外線處理對出發(fā)菌株存活的影響 ?紫外線對出發(fā)菌株的誘變致死曲線見圖2。從圖2可知，隨著紫外線照射時間延長，菊糖芽孢乳桿菌的致死率逐漸升高，有研究表明，較低劑量容易出現(xiàn)正突變，一般選擇致死率為70%～80%的劑量。從紫外線致死曲線可看出，當(dāng)照射時間為20 s時致死率達到80.7%。因此選擇20 s作為紫外誘變的最佳誘變時間。

2.2.2 ?紫外線誘變突變株的篩選

1）紫外誘變突變株的平板初篩。對L0紫外線誘變后，挑取單菌落，測定HC值，并進行編號，結(jié)果見表1。由表1可看出，在挑選的16株單菌落中有8株的HC值比出發(fā)菌株L0大。選擇這8株突變株進行發(fā)酵復(fù)篩。

2）紫外誘變突變株的發(fā)酵復(fù)篩。對HC值比出發(fā)菌株L0大的8株突變株進行發(fā)酵培養(yǎng)，由表2可以看出，U6、U8、U9的D-乳酸產(chǎn)量高于L0，而其他菌種的D-乳酸產(chǎn)量低于L0，說明僅有U6、U8、U9菌株發(fā)生了正向突變，其他菌種則發(fā)生了負向突變，所以對U6、U8、U9菌株進行穩(wěn)定性試驗。

3）紫外誘變突變株的穩(wěn)定性試驗。分別對這3株菌進行發(fā)酵傳代試驗，每株菌傳代7次，從表3中可以看出，3株菌的遺傳穩(wěn)定性均較好，但是U6的乳酸產(chǎn)量最高，所以選擇U6紫外誘變菌株進行下一步試驗。

2.2.3 ?硫酸二乙酯（DES）誘變突變株的選育結(jié)果

1）硫酸二乙酯誘變致死曲線的繪制。DES對紫外誘變菌株U6的誘變致死曲線見圖3。從圖3可知，隨著DES作用時間的延長，U6菌株的致死率逐漸升高。從DES致死曲線可看出，當(dāng)處理時間為25 min時致死率大約為80%。因此選擇25 min作為硫酸二乙酯誘變的最佳誘變時間。

2）DES誘變突變株的平板初篩。對U6菌株進行DES誘變后，挑取單菌落，測定HC值，并進行編號，結(jié)果見表4。由表4可看出，在挑選的13株單菌落中有7株的HC值比出發(fā)菌株U6大，所以選擇這7株突變株進行發(fā)酵復(fù)篩。

3）硫酸二乙酯誘變突變株的發(fā)酵復(fù)篩。對HC值比出發(fā)菌株U6大的7株突變株進行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果見表5。經(jīng)反復(fù)試驗，D1、D5、D10和D11的D-乳酸產(chǎn)量均高于U6。所以選用這4株誘變菌株進行第二輪搖瓶發(fā)酵復(fù)篩試驗。

4）DES誘變突變株的遺傳穩(wěn)定性試驗。分別將這4株菌連續(xù)傳代7次，每代分別進行發(fā)酵測定D-乳酸產(chǎn)量，結(jié)果見表6。從表6中可以看出，4株菌的遺傳穩(wěn)定性均較好，但是D11誘變菌株的乳酸產(chǎn)量最高，而且每一代的乳酸產(chǎn)量變化不大，故選擇突變株D11為目標(biāo)菌株。

2.3 ?對誘變菌株發(fā)酵條件的研究

在得到一株遺傳穩(wěn)定性好的菌株后，需要對其發(fā)酵條件進行研究。試驗就其發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、初始pH、轉(zhuǎn)速、接種量和裝液量進行了單因素試驗驗（圖4）。從圖4中可以得出，在發(fā)酵時間為68 h，發(fā)酵溫度為37 ℃，初始pH為6.5，轉(zhuǎn)速為160 r/min，接種量為5%，裝液量為50 mL/250 mL是該紫外、硫酸二乙酯誘變菌株的最佳誘變條件。

在最佳發(fā)酵條件下，對該菌株進行驗證發(fā)酵試驗，D-乳酸的產(chǎn)量達到56.18 g/L，表明此發(fā)酵條件的可行。

3 ?小結(jié)與討論

通過對L0進行紫外線和硫酸二乙酯的誘變，碳酸鈣平板初篩及搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，從大量突變株中篩選得到一株D-乳酸變異菌株D11，其D-乳酸的產(chǎn)量從最初的37.57 g/L提高到50.84 g/L，提高了35.32%。連續(xù)傳代7次，D-乳酸產(chǎn)量變化不大，說明該突變菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性，之后又通過對發(fā)酵條件的單因素試驗，結(jié)果表明在發(fā)酵時間為68 h，發(fā)酵溫度為37 ℃，初始pH為6.5，轉(zhuǎn)速為160 r/min，接種量為5%，裝液量為50 mL/250 mL時，該誘變菌株的D-乳酸產(chǎn)量達到了56.18 g/L，比出發(fā)菌種提高了49.53%。與付衛(wèi)明[9]、李小平等[10]的研究結(jié)果相比，本試驗的發(fā)酵時間明顯縮短，紫外照射時間明顯減少，但是D-乳酸產(chǎn)量仍然較高，且與出發(fā)菌株相比，D-乳酸的產(chǎn)量增高明顯。而且此誘變條件操作簡單，容易達到，成本節(jié)約，也為該菌的工業(yè)化生產(chǎn)D-乳酸奠定了一定的基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] 胡永紅，管 ?珺，楊文革，等.發(fā)酵法生產(chǎn)D-乳酸的研究進展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（12）：99-103.

[2] 周 ?麗.高產(chǎn)高純D-乳酸的E.coli代謝工程菌的構(gòu)建[D].江蘇無錫：江南大學(xué)，2012.

[3] 王雅君，陳力力，廖杰瓊，等.微生物物理誘變育種方法的研究進展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工（創(chuàng)新版），2013（2）：25-31.

[4] DEMIRCI A， POMETTO A L. Enhanced production of D（-）-lactic acid by mutants of Lactobacillus delbrueckii ATCC 9649 [J].Journal of Industrial Microbiology，1992（11）：23-28.

[5] XU T T， BAI Z Z， WANG L J， et al. Breeding of D（-）-lactic acid high producing strain by low-energy ion implantation and preliminary analysis of related metabolism[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology，2010，160（2）：314-321.

[6] 于培星.高產(chǎn)D-乳酸生產(chǎn)菌株的選育[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報， 2010，29（5）：798-800.

[7] 楊潔彬，李淑高，張 ?箎，等.食品微生物[M].北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1989.

[8] 鄭 ?志，姜紹通，潘麗軍.EDTA定鈣法測定發(fā)酵液中乳酸含量的探討[J].食品科學(xué)，2003，24（3）：102-105.

[9] 付衛(wèi)明.D-乳酸高產(chǎn)菌株的誘變選育及其發(fā)酵條件的優(yōu)化[D].天津：天津大學(xué)，2003.

[10] 李小平，魏玲玲，張慧發(fā)，等.保加利亞乳桿菌乳酸高產(chǎn)菌株的紫外誘變選育[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，30（1）：88-90.

3）紫外誘變突變株的穩(wěn)定性試驗。分別對這3株菌進行發(fā)酵傳代試驗，每株菌傳代7次，從表3中可以看出，3株菌的遺傳穩(wěn)定性均較好，但是U6的乳酸產(chǎn)量最高，所以選擇U6紫外誘變菌株進行下一步試驗。

2.2.3 ?硫酸二乙酯（DES）誘變突變株的選育結(jié)果

1）硫酸二乙酯誘變致死曲線的繪制。DES對紫外誘變菌株U6的誘變致死曲線見圖3。從圖3可知，隨著DES作用時間的延長，U6菌株的致死率逐漸升高。從DES致死曲線可看出，當(dāng)處理時間為25 min時致死率大約為80%。因此選擇25 min作為硫酸二乙酯誘變的最佳誘變時間。

2）DES誘變突變株的平板初篩。對U6菌株進行DES誘變后，挑取單菌落，測定HC值，并進行編號，結(jié)果見表4。由表4可看出，在挑選的13株單菌落中有7株的HC值比出發(fā)菌株U6大，所以選擇這7株突變株進行發(fā)酵復(fù)篩。

3）硫酸二乙酯誘變突變株的發(fā)酵復(fù)篩。對HC值比出發(fā)菌株U6大的7株突變株進行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果見表5。經(jīng)反復(fù)試驗，D1、D5、D10和D11的D-乳酸產(chǎn)量均高于U6。所以選用這4株誘變菌株進行第二輪搖瓶發(fā)酵復(fù)篩試驗。

4）DES誘變突變株的遺傳穩(wěn)定性試驗。分別將這4株菌連續(xù)傳代7次，每代分別進行發(fā)酵測定D-乳酸產(chǎn)量，結(jié)果見表6。從表6中可以看出，4株菌的遺傳穩(wěn)定性均較好，但是D11誘變菌株的乳酸產(chǎn)量最高，而且每一代的乳酸產(chǎn)量變化不大，故選擇突變株D11為目標(biāo)菌株。

2.3 ?對誘變菌株發(fā)酵條件的研究

在得到一株遺傳穩(wěn)定性好的菌株后，需要對其發(fā)酵條件進行研究。試驗就其發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、初始pH、轉(zhuǎn)速、接種量和裝液量進行了單因素試驗驗（圖4）。從圖4中可以得出，在發(fā)酵時間為68 h，發(fā)酵溫度為37 ℃，初始pH為6.5，轉(zhuǎn)速為160 r/min，接種量為5%，裝液量為50 mL/250 mL是該紫外、硫酸二乙酯誘變菌株的最佳誘變條件。

在最佳發(fā)酵條件下，對該菌株進行驗證發(fā)酵試驗，D-乳酸的產(chǎn)量達到56.18 g/L，表明此發(fā)酵條件的可行。

3 ?小結(jié)與討論

通過對L0進行紫外線和硫酸二乙酯的誘變，碳酸鈣平板初篩及搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，從大量突變株中篩選得到一株D-乳酸變異菌株D11，其D-乳酸的產(chǎn)量從最初的37.57 g/L提高到50.84 g/L，提高了35.32%。連續(xù)傳代7次，D-乳酸產(chǎn)量變化不大，說明該突變菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性，之后又通過對發(fā)酵條件的單因素試驗，結(jié)果表明在發(fā)酵時間為68 h，發(fā)酵溫度為37 ℃，初始pH為6.5，轉(zhuǎn)速為160 r/min，接種量為5%，裝液量為50 mL/250 mL時，該誘變菌株的D-乳酸產(chǎn)量達到了56.18 g/L，比出發(fā)菌種提高了49.53%。與付衛(wèi)明[9]、李小平等[10]的研究結(jié)果相比，本試驗的發(fā)酵時間明顯縮短，紫外照射時間明顯減少，但是D-乳酸產(chǎn)量仍然較高，且與出發(fā)菌株相比，D-乳酸的產(chǎn)量增高明顯。而且此誘變條件操作簡單，容易達到，成本節(jié)約，也為該菌的工業(yè)化生產(chǎn)D-乳酸奠定了一定的基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] 胡永紅，管 ?珺，楊文革，等.發(fā)酵法生產(chǎn)D-乳酸的研究進展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（12）：99-103.

[2] 周 ?麗.高產(chǎn)高純D-乳酸的E.coli代謝工程菌的構(gòu)建[D].江蘇無錫：江南大學(xué)，2012.

[3] 王雅君，陳力力，廖杰瓊，等.微生物物理誘變育種方法的研究進展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工（創(chuàng)新版），2013（2）：25-31.

[4] DEMIRCI A， POMETTO A L. Enhanced production of D（-）-lactic acid by mutants of Lactobacillus delbrueckii ATCC 9649 [J].Journal of Industrial Microbiology，1992（11）：23-28.

[5] XU T T， BAI Z Z， WANG L J， et al. Breeding of D（-）-lactic acid high producing strain by low-energy ion implantation and preliminary analysis of related metabolism[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology，2010，160（2）：314-321.

[6] 于培星.高產(chǎn)D-乳酸生產(chǎn)菌株的選育[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報， 2010，29（5）：798-800.

[7] 楊潔彬，李淑高，張 ?箎，等.食品微生物[M].北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1989.

[8] 鄭 ?志，姜紹通，潘麗軍.EDTA定鈣法測定發(fā)酵液中乳酸含量的探討[J].食品科學(xué)，2003，24（3）：102-105.

[9] 付衛(wèi)明.D-乳酸高產(chǎn)菌株的誘變選育及其發(fā)酵條件的優(yōu)化[D].天津：天津大學(xué)，2003.

[10] 李小平，魏玲玲，張慧發(fā)，等.保加利亞乳桿菌乳酸高產(chǎn)菌株的紫外誘變選育[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，30（1）：88-90.

3）紫外誘變突變株的穩(wěn)定性試驗。分別對這3株菌進行發(fā)酵傳代試驗，每株菌傳代7次，從表3中可以看出，3株菌的遺傳穩(wěn)定性均較好，但是U6的乳酸產(chǎn)量最高，所以選擇U6紫外誘變菌株進行下一步試驗。

2.2.3 ?硫酸二乙酯（DES）誘變突變株的選育結(jié)果

1）硫酸二乙酯誘變致死曲線的繪制。DES對紫外誘變菌株U6的誘變致死曲線見圖3。從圖3可知，隨著DES作用時間的延長，U6菌株的致死率逐漸升高。從DES致死曲線可看出，當(dāng)處理時間為25 min時致死率大約為80%。因此選擇25 min作為硫酸二乙酯誘變的最佳誘變時間。

2）DES誘變突變株的平板初篩。對U6菌株進行DES誘變后，挑取單菌落，測定HC值，并進行編號，結(jié)果見表4。由表4可看出，在挑選的13株單菌落中有7株的HC值比出發(fā)菌株U6大，所以選擇這7株突變株進行發(fā)酵復(fù)篩。

3）硫酸二乙酯誘變突變株的發(fā)酵復(fù)篩。對HC值比出發(fā)菌株U6大的7株突變株進行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果見表5。經(jīng)反復(fù)試驗，D1、D5、D10和D11的D-乳酸產(chǎn)量均高于U6。所以選用這4株誘變菌株進行第二輪搖瓶發(fā)酵復(fù)篩試驗。

4）DES誘變突變株的遺傳穩(wěn)定性試驗。分別將這4株菌連續(xù)傳代7次，每代分別進行發(fā)酵測定D-乳酸產(chǎn)量，結(jié)果見表6。從表6中可以看出，4株菌的遺傳穩(wěn)定性均較好，但是D11誘變菌株的乳酸產(chǎn)量最高，而且每一代的乳酸產(chǎn)量變化不大，故選擇突變株D11為目標(biāo)菌株。

2.3 ?對誘變菌株發(fā)酵條件的研究

在得到一株遺傳穩(wěn)定性好的菌株后，需要對其發(fā)酵條件進行研究。試驗就其發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、初始pH、轉(zhuǎn)速、接種量和裝液量進行了單因素試驗驗（圖4）。從圖4中可以得出，在發(fā)酵時間為68 h，發(fā)酵溫度為37 ℃，初始pH為6.5，轉(zhuǎn)速為160 r/min，接種量為5%，裝液量為50 mL/250 mL是該紫外、硫酸二乙酯誘變菌株的最佳誘變條件。

在最佳發(fā)酵條件下，對該菌株進行驗證發(fā)酵試驗，D-乳酸的產(chǎn)量達到56.18 g/L，表明此發(fā)酵條件的可行。

3 ?小結(jié)與討論

通過對L0進行紫外線和硫酸二乙酯的誘變，碳酸鈣平板初篩及搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，從大量突變株中篩選得到一株D-乳酸變異菌株D11，其D-乳酸的產(chǎn)量從最初的37.57 g/L提高到50.84 g/L，提高了35.32%。連續(xù)傳代7次，D-乳酸產(chǎn)量變化不大，說明該突變菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性，之后又通過對發(fā)酵條件的單因素試驗，結(jié)果表明在發(fā)酵時間為68 h，發(fā)酵溫度為37 ℃，初始pH為6.5，轉(zhuǎn)速為160 r/min，接種量為5%，裝液量為50 mL/250 mL時，該誘變菌株的D-乳酸產(chǎn)量達到了56.18 g/L，比出發(fā)菌種提高了49.53%。與付衛(wèi)明[9]、李小平等[10]的研究結(jié)果相比，本試驗的發(fā)酵時間明顯縮短，紫外照射時間明顯減少，但是D-乳酸產(chǎn)量仍然較高，且與出發(fā)菌株相比，D-乳酸的產(chǎn)量增高明顯。而且此誘變條件操作簡單，容易達到，成本節(jié)約，也為該菌的工業(yè)化生產(chǎn)D-乳酸奠定了一定的基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] 胡永紅，管 ?珺，楊文革，等.發(fā)酵法生產(chǎn)D-乳酸的研究進展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（12）：99-103.

[2] 周 ?麗.高產(chǎn)高純D-乳酸的E.coli代謝工程菌的構(gòu)建[D].江蘇無錫：江南大學(xué)，2012.

[3] 王雅君，陳力力，廖杰瓊，等.微生物物理誘變育種方法的研究進展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工（創(chuàng)新版），2013（2）：25-31.

[4] DEMIRCI A， POMETTO A L. Enhanced production of D（-）-lactic acid by mutants of Lactobacillus delbrueckii ATCC 9649 [J].Journal of Industrial Microbiology，1992（11）：23-28.

[5] XU T T， BAI Z Z， WANG L J， et al. Breeding of D（-）-lactic acid high producing strain by low-energy ion implantation and preliminary analysis of related metabolism[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology，2010，160（2）：314-321.

[6] 于培星.高產(chǎn)D-乳酸生產(chǎn)菌株的選育[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報， 2010，29（5）：798-800.

[7] 楊潔彬，李淑高，張 ?箎，等.食品微生物[M].北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1989.

[8] 鄭 ?志，姜紹通，潘麗軍.EDTA定鈣法測定發(fā)酵液中乳酸含量的探討[J].食品科學(xué)，2003，24（3）：102-105.

[9] 付衛(wèi)明.D-乳酸高產(chǎn)菌株的誘變選育及其發(fā)酵條件的優(yōu)化[D].天津：天津大學(xué)，2003.

[10] 李小平，魏玲玲，張慧發(fā)，等.保加利亞乳桿菌乳酸高產(chǎn)菌株的紫外誘變選育[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，30（1）：88-90.