喬宇+游江+汪蘭+吳文錦+丁安子+高虹+史德芳+陳學(xué)玲+王俊+程薇+廖李

摘要：利用響應(yīng)面法優(yōu)化了纖維素酶法提取山藥（Dioscorea opposita Thunb）多糖的工藝條件。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對提取時(shí)間、提取溫度、pH 3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，建立了山藥多糖提取率的二次回歸方程，通過響應(yīng)面分析及嶺嵴分析得到最優(yōu)提取工藝為料液比1∶20（m/V，g∶mL），加酶量12 U/g，提取溫度42 ℃、提取時(shí)間163.5 min，pH ?4.09，該條件下山藥多糖的提取率為6.082%。

關(guān)鍵詞：山藥（Dioscorea opposita Thunb）多糖;提取;纖維素酶;響應(yīng)面法

中圖分類號：Q556 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）20-4926-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.041

Optimization of Extracting Polysaccharide from Chinese Yam Root Using Cellulase

QIAO Yu，YOU Jiang，WANG Lan，WU Wen-jin，DING An-zi，GAO Hong，SHI De-fang，CHEN Xue-ling，

WANG Jun，CHENG Wei，LIAO Li

（Agricultural Products Processing Subcenter of Hubei Agricultural Science Technology Innovation Center / Research Institute of Agricultural Products Processing and Nuclear-Agricultural Technology， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China）

Abstract： The conditions of extracting polysaccharide from Chinese yam root was optimized by response surface analysis. According to the single-factor experiments， three levels of the factors including extraction temperature， extraction time and pH value were selected to establish a quadric regression equation for describing the yield of polysaccharide from Chinese yam root. Through response surface analysis， the optimal conditions were the liquid to solid ratio of 1∶20， the enzyme concentration of 12 U/g，extraction temperature of 42 ℃，time of 163.5 min and pH of 4.09. The estimated value and verified value of polysaccharide was 6.082% under the optimal conditions.

Key words： polysaccharide from Chinese Yam Root;extraction;cellulase;response surface methodology

山藥（Dioscorea opposita Thunb）是薯蕷類植物的根莖，具有補(bǔ)中益氣、消渴生津、保健養(yǎng)顏、滋腎益精、益肺止咳等功效[1]，其脂肪含量極低，富含多酚氧化酶、皂甙、黃酮、游離氨基酸、蛋白質(zhì)、多種微量元素等[2]。多糖是山藥的主要活性成分之一，有一定的抗氧化活性和降血糖作用，能刺激和調(diào)節(jié)人體的免疫功能，增強(qiáng)白細(xì)胞的吞噬功能[3]。目前多糖的提取方法主要有水提法[4]、酶解法[5]、微波和超聲波[6]等輔助提取法、膜分離和超臨界萃取等方法。纖維素酶法已經(jīng)越來越多的用于植物多糖的提取，纖維素酶能破壞植物細(xì)胞壁的致密結(jié)構(gòu)，加速多糖的溶出，從而提高提取率[7]。本試驗(yàn)在水浸提法的基礎(chǔ)上采用纖維素酶法來提高山藥多糖的提取率，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對提取時(shí)間、提取溫度、pH 3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，旨在建立纖維素酶法提取山藥多糖的最優(yōu)工藝，為山藥多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料

山藥粉（200目）：湖北省利川市匯川現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司提供;纖維素酶：酶活10 000 U/g，日本ONOZUKA公司;濃硫酸、苯酚、無水乙醇、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖等均為分析純試劑。

試驗(yàn)儀器：LXJ-ⅡB型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）;DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌水浴鍋（武漢科爾儀器設(shè)備有限公司）;3802型紫外可見分光光度計(jì)（尤尼克儀器有限公司）;PL2001型分析天平（Sartorius科學(xué)儀器有限公司）;RE40型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮升華儀器廠）;PB-10型pH計(jì)（Sartorius科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 ?試驗(yàn)方法

1.2.1 ?山藥多糖的提取 ?準(zhǔn)確稱取山藥粉5 g，添加一定量的纖維素酶，加入100 mL的去離子水并調(diào)節(jié)pH，在設(shè)定溫度的水浴鍋中提取一定的時(shí)間后，提取液在 4 500 r/min條件下離心20 min，上清液濃縮后加入4倍體積的95%乙醇于4 ℃的冰箱中過夜后離心，沉淀即為山藥多糖。

1.2.2 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 ?準(zhǔn)確稱取105 ℃下烘干至恒重的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖1 g，溶解后定容至1 L，分別取上述標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液1、2、3、4、5、6 mL于100 mL容量瓶中定容。取上述溶液各1 mL于比色管中，加1 mL 6%苯酚溶液和5 mL濃硫酸，搖勻后靜置20 min，于490 nm波長下測吸光度[8]。以葡糖糖濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立測定多糖含量的回歸方程y=10 388x-0.018 4，R2 =0.998 7。

1.2.3 ?多糖含量的測定 ?取1 mL多糖提取液、1 mL 6%苯酚、5 mL濃硫酸搖勻后靜置20 min，490 nm波長下測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。

1.2.4 ?多糖提取率的計(jì)算 ?提取率=M1/M2×100%。式中：M1為提取物中多糖質(zhì)量;M2為山藥粉質(zhì)量。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 ?提取溫度對多糖提取率的影響 ?在加酶量為12 U/g，料液比1∶20（m/V，g∶mL，下同），pH 4.5，提取溫度分別為35、40、45、50、55 ℃，提取120 min，上清液加入4倍體積的95%乙醇的條件下，考察提取溫度對多糖提取率的影響（圖1）。由圖1 可知，隨著提取溫度的升高，多糖提取率上升，但當(dāng)溫度高于40 ℃時(shí)，提取率反而下降，因?yàn)闇囟葘w維素酶的結(jié)構(gòu)會產(chǎn)生影響，溫度過高會使酶活性下降造成提取率下降。

2.1.2 ?提取時(shí)間對多糖提取率的影響 ?在加酶量為12 U/g，料液比1∶20，pH 4.5， 40 ℃分別提取60、90、120、150、180 min，上清液加入4倍體積的95%乙醇的條件下，考察提取時(shí)間對多糖提取率的影響（圖2）。由圖2可知，隨著提取時(shí)間的延長，山藥多糖提取率也隨之增加，當(dāng)提取時(shí)間為150 min時(shí)，提取率基本達(dá)到平衡，之后延長提取時(shí)間不能顯著提高多糖提取率。

2.1.3 ?pH對提取率的影響 ?在加酶量為12 U/g，料液比1∶20，pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0， 40 ℃提取150 min，上清液加入4倍體積的95%乙醇的條件下，考察pH對多糖提取率的影響（圖3）。由圖3可知，隨著pH的升高，多糖的提取率逐漸增高，在pH為4.5時(shí)提取率達(dá)到最大，但隨著pH繼續(xù)升高，提取率反而下降，這與酶的活性有關(guān)。pH的改變會影響酶分子與底物的結(jié)合與催化，只有在特定的pH下，酶的活性才能達(dá)到最佳，從而使提取率達(dá)到最大值。

2.1.4 ?加酶量對提取率的影響 ?在加酶量分別為3、6、9、12、15 U/g，料液比1∶20，pH 4.5， 40 ℃提取150 min，上清液加入4倍體積的95%乙醇的條件下，考察加酶量對多糖提取率的影響（圖4）。由圖4可知，隨著加酶量的增加，提取率也隨之增加，加酶量為12 U/g時(shí)提取率最高，當(dāng)加酶量繼續(xù)增大，提取率反而下降，可能的原因是在加酶量較低時(shí)酶可以和底物充分接觸，所以隨著酶量的增加提取率逐漸上升直到最高，但當(dāng)酶量增加至較高時(shí)，底物不能滿足酶的要求，酶的活性被抑制，提取率反而下降。

2.1.5 ?料液比對提取率的影響 ?在加酶量為12 U/g，料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，pH為4.5， 40 ℃提取150 min，上清液加入4倍體積的95%乙醇的條件下，考察料液比對多糖提取率的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著料液比的降低，提取率逐漸增加，料液比為1∶20時(shí)提取率最大，之后隨著料液比的繼續(xù)降低，提取率基本不變。

2.2 ?響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 ?響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其響應(yīng)值分析 ?根據(jù)以上單因素的試驗(yàn)結(jié)果，在加酶量為12 U/g、料液比為1∶20、沉淀時(shí)乙醇與提取液體積比為4∶1的條件下選取提取溫度、pH、提取時(shí)間3因素，因素與水平見表1，Box-Benhnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表2。以多糖提取率為Y值，通過SAS軟件的RSREG程序?qū)υ囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析（RSA），并作出響應(yīng)面圖和等高線圖，經(jīng)回歸擬合后求得回歸方程為：

Y=6.100+0.040 0X1-0.013 7X2+0.538 7X3-0.371 2X12-0.190 0X1X2-0.023 7X22+0.255 0X1X3-0.077 5X2X3-0.723 7X32

Box-Benhnken響應(yīng)面方差分析見表3，模型的F=11.14，P<0.01，說明Box-Benhnken回歸模型高度顯著，一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和總回歸都達(dá)到了極顯著水平，說明方程擬合得很好，因此可用該二次回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析。

2.2.2 ?Box-Benhnken響應(yīng)面圖 ?回歸模型的響應(yīng)面見圖6、圖7和圖8。從圖6可得出多糖提取率隨提取溫度的升高而增加，在提取溫度為40 ℃時(shí)提取率最大，隨后隨溫度的升高提取率下降;多糖提取率隨提取時(shí)間的增加而增大，在提取時(shí)間為150 min時(shí)提取率最大，然后隨提取時(shí)間的增加提取率下降。等高線為橢圓可知提取溫度和提取時(shí)間的交互作用對山藥多糖提取率影響顯著。由圖7和圖8的等高線可知，提取溫度和pH的交互作用對山藥多糖提取率的影響不顯著，pH和提取時(shí)間的交互作用對山藥多糖提取率影響不顯著。

2.2.3 ?嶺嵴分析 ?從典型分析表4可以看出，3個(gè)因素的特征值有正有負(fù)，表明此二次響應(yīng)面是鞍面，無極值存在;同時(shí)，這與以上響應(yīng)面圖的直觀顯示結(jié)果是一致的。因此不能直接從此二次響應(yīng)面上找出最佳工藝參數(shù)，需要進(jìn)一步作嶺嵴分析。通過SAS軟件調(diào)用嶺脊分析的程序，對自變量提取溫度、pH和提取時(shí)間進(jìn)行Sort由小到大的排序，再運(yùn)用Lackfit程序要求對Box-Benhnken響應(yīng)面回歸模型進(jìn)行嶺嵴分析，嶺嵴分析結(jié)果見表5。由表5可知，隨著編碼半徑R的增大，提取率也在逐漸增大，即多糖的提取率隨提取溫度、pH和提取時(shí)間的增大而增大。當(dāng)R最大為1.0時(shí)即試驗(yàn)最適提取溫度為41.840 ℃、pH 4.093、提取時(shí)間為163.502 min，理論上多糖的提取率為6.283 283%，考慮到實(shí)際情況，取提取溫度為42 ℃、pH 4.09、提取時(shí)間為163.5 min來進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，此時(shí)山藥多糖提取率為6.082%，與預(yù)測值基本一致。

3 ? 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法得到山藥多糖的最佳提取工藝為料液比1∶20，加酶量12 U/g，提取溫度42 ℃，提取時(shí)間163.5 min，pH為4.09，在此條件下山藥多糖的提取率為6.082%。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳佳希，李多偉.山藥的功能及有效成分研究進(jìn)展[J].西北藥學(xué)雜志，2010，25（5）：398-340.

[2] 袁書林.山藥的化學(xué)成分和生物活性作用研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā)，2008，29（3）：176-179.

[3] 楊宏莉，李少春，張偉偉，等.山藥多糖的藥理作用[J].醫(yī)學(xué)研究與教育，2010，27（3）：80-82.

[4] 顧 ?林，姜 ?軍.山藥多糖的分離純化及組成研究[J].食品科學(xué)，2007，28（9）：158-161.

[5] 張 ?元，林 ?強(qiáng)，魏靜娜，等.酶法提取山藥中多糖的工藝研究[J].中國中藥雜志，2008，33（4）：374-379.

[6] 李 ?萍，孔明航.超聲波協(xié)同纖維素酶提取山藥多糖的工藝及組分測定研究[J].農(nóng)產(chǎn)食品科技，2009，3（3）：24-28.

[7] 費(fèi)玉婷，喬建衛(wèi)，蔣立勤.纖維素酶法提取山藥多糖的工藝研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2008，6（6）：32-34.

[8] 孫仕玲.山藥多糖含量的測定方法研究[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2010，30（3）：35-39.

2.2.3 ?嶺嵴分析 ?從典型分析表4可以看出，3個(gè)因素的特征值有正有負(fù)，表明此二次響應(yīng)面是鞍面，無極值存在;同時(shí)，這與以上響應(yīng)面圖的直觀顯示結(jié)果是一致的。因此不能直接從此二次響應(yīng)面上找出最佳工藝參數(shù)，需要進(jìn)一步作嶺嵴分析。通過SAS軟件調(diào)用嶺脊分析的程序，對自變量提取溫度、pH和提取時(shí)間進(jìn)行Sort由小到大的排序，再運(yùn)用Lackfit程序要求對Box-Benhnken響應(yīng)面回歸模型進(jìn)行嶺嵴分析，嶺嵴分析結(jié)果見表5。由表5可知，隨著編碼半徑R的增大，提取率也在逐漸增大，即多糖的提取率隨提取溫度、pH和提取時(shí)間的增大而增大。當(dāng)R最大為1.0時(shí)即試驗(yàn)最適提取溫度為41.840 ℃、pH 4.093、提取時(shí)間為163.502 min，理論上多糖的提取率為6.283 283%，考慮到實(shí)際情況，取提取溫度為42 ℃、pH 4.09、提取時(shí)間為163.5 min來進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，此時(shí)山藥多糖提取率為6.082%，與預(yù)測值基本一致。

3 ? 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法得到山藥多糖的最佳提取工藝為料液比1∶20，加酶量12 U/g，提取溫度42 ℃，提取時(shí)間163.5 min，pH為4.09，在此條件下山藥多糖的提取率為6.082%。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳佳希，李多偉.山藥的功能及有效成分研究進(jìn)展[J].西北藥學(xué)雜志，2010，25（5）：398-340.

[2] 袁書林.山藥的化學(xué)成分和生物活性作用研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā)，2008，29（3）：176-179.

[3] 楊宏莉，李少春，張偉偉，等.山藥多糖的藥理作用[J].醫(yī)學(xué)研究與教育，2010，27（3）：80-82.

[4] 顧 ?林，姜 ?軍.山藥多糖的分離純化及組成研究[J].食品科學(xué)，2007，28（9）：158-161.

[5] 張 ?元，林 ?強(qiáng)，魏靜娜，等.酶法提取山藥中多糖的工藝研究[J].中國中藥雜志，2008，33（4）：374-379.

[6] 李 ?萍，孔明航.超聲波協(xié)同纖維素酶提取山藥多糖的工藝及組分測定研究[J].農(nóng)產(chǎn)食品科技，2009，3（3）：24-28.

[7] 費(fèi)玉婷，喬建衛(wèi)，蔣立勤.纖維素酶法提取山藥多糖的工藝研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2008，6（6）：32-34.

[8] 孫仕玲.山藥多糖含量的測定方法研究[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2010，30（3）：35-39.

2.2.3 ?嶺嵴分析 ?從典型分析表4可以看出，3個(gè)因素的特征值有正有負(fù)，表明此二次響應(yīng)面是鞍面，無極值存在;同時(shí)，這與以上響應(yīng)面圖的直觀顯示結(jié)果是一致的。因此不能直接從此二次響應(yīng)面上找出最佳工藝參數(shù)，需要進(jìn)一步作嶺嵴分析。通過SAS軟件調(diào)用嶺脊分析的程序，對自變量提取溫度、pH和提取時(shí)間進(jìn)行Sort由小到大的排序，再運(yùn)用Lackfit程序要求對Box-Benhnken響應(yīng)面回歸模型進(jìn)行嶺嵴分析，嶺嵴分析結(jié)果見表5。由表5可知，隨著編碼半徑R的增大，提取率也在逐漸增大，即多糖的提取率隨提取溫度、pH和提取時(shí)間的增大而增大。當(dāng)R最大為1.0時(shí)即試驗(yàn)最適提取溫度為41.840 ℃、pH 4.093、提取時(shí)間為163.502 min，理論上多糖的提取率為6.283 283%，考慮到實(shí)際情況，取提取溫度為42 ℃、pH 4.09、提取時(shí)間為163.5 min來進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，此時(shí)山藥多糖提取率為6.082%，與預(yù)測值基本一致。

3 ? 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法得到山藥多糖的最佳提取工藝為料液比1∶20，加酶量12 U/g，提取溫度42 ℃，提取時(shí)間163.5 min，pH為4.09，在此條件下山藥多糖的提取率為6.082%。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳佳希，李多偉.山藥的功能及有效成分研究進(jìn)展[J].西北藥學(xué)雜志，2010，25（5）：398-340.

[2] 袁書林.山藥的化學(xué)成分和生物活性作用研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā)，2008，29（3）：176-179.

[3] 楊宏莉，李少春，張偉偉，等.山藥多糖的藥理作用[J].醫(yī)學(xué)研究與教育，2010，27（3）：80-82.

[4] 顧 ?林，姜 ?軍.山藥多糖的分離純化及組成研究[J].食品科學(xué)，2007，28（9）：158-161.

[5] 張 ?元，林 ?強(qiáng)，魏靜娜，等.酶法提取山藥中多糖的工藝研究[J].中國中藥雜志，2008，33（4）：374-379.

[6] 李 ?萍，孔明航.超聲波協(xié)同纖維素酶提取山藥多糖的工藝及組分測定研究[J].農(nóng)產(chǎn)食品科技，2009，3（3）：24-28.

[7] 費(fèi)玉婷，喬建衛(wèi)，蔣立勤.纖維素酶法提取山藥多糖的工藝研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2008，6（6）：32-34.

[8] 孫仕玲.山藥多糖含量的測定方法研究[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2010，30（3）：35-39.

2.2.3 ?嶺嵴分析 ?從典型分析表4可以看出，3個(gè)因素的特征值有正有負(fù)，表明此二次響應(yīng)面是鞍面，無極值存在;同時(shí)，這與以上響應(yīng)面圖的直觀顯示結(jié)果是一致的。因此不能直接從此二次響應(yīng)面上找出最佳工藝參數(shù)，需要進(jìn)一步作嶺嵴分析。通過SAS軟件調(diào)用嶺脊分析的程序，對自變量提取溫度、pH和提取時(shí)間進(jìn)行Sort由小到大的排序，再運(yùn)用Lackfit程序要求對Box-Benhnken響應(yīng)面回歸模型進(jìn)行嶺嵴分析，嶺嵴分析結(jié)果見表5。由表5可知，隨著編碼半徑R的增大，提取率也在逐漸增大，即多糖的提取率隨提取溫度、pH和提取時(shí)間的增大而增大。當(dāng)R最大為1.0時(shí)即試驗(yàn)最適提取溫度為41.840 ℃、pH 4.093、提取時(shí)間為163.502 min，理論上多糖的提取率為6.283 283%，考慮到實(shí)際情況，取提取溫度為42 ℃、pH 4.09、提取時(shí)間為163.5 min來進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，此時(shí)山藥多糖提取率為6.082%，與預(yù)測值基本一致。

3 ? 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法得到山藥多糖的最佳提取工藝為料液比1∶20，加酶量12 U/g，提取溫度42 ℃，提取時(shí)間163.5 min，pH為4.09，在此條件下山藥多糖的提取率為6.082%。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳佳希，李多偉.山藥的功能及有效成分研究進(jìn)展[J].西北藥學(xué)雜志，2010，25（5）：398-340.

[2] 袁書林.山藥的化學(xué)成分和生物活性作用研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā)，2008，29（3）：176-179.

[3] 楊宏莉，李少春，張偉偉，等.山藥多糖的藥理作用[J].醫(yī)學(xué)研究與教育，2010，27（3）：80-82.

[4] 顧 ?林，姜 ?軍.山藥多糖的分離純化及組成研究[J].食品科學(xué)，2007，28（9）：158-161.

[5] 張 ?元，林 ?強(qiáng)，魏靜娜，等.酶法提取山藥中多糖的工藝研究[J].中國中藥雜志，2008，33（4）：374-379.

[6] 李 ?萍，孔明航.超聲波協(xié)同纖維素酶提取山藥多糖的工藝及組分測定研究[J].農(nóng)產(chǎn)食品科技，2009，3（3）：24-28.

[7] 費(fèi)玉婷，喬建衛(wèi)，蔣立勤.纖維素酶法提取山藥多糖的工藝研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2008，6（6）：32-34.

[8] 孫仕玲.山藥多糖含量的測定方法研究[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2010，30（3）：35-39.