葉云+鐘英英+張倩

摘要：為了獲得犬乳腺癌轉(zhuǎn)移早期的分子標(biāo)記，比較了27個(gè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移/不轉(zhuǎn)移犬乳腺癌樣本的基因芯片數(shù)據(jù)，獲得了775個(gè)差異表達(dá)基因，并用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行基因表達(dá)的單因素分析得到38個(gè)與生存顯著相關(guān)的基因。在此基礎(chǔ)上用懲罰Cox模型對(duì)樣本進(jìn)行生存預(yù)測(cè)，得到10個(gè)基因的分類(lèi)器，可以比較準(zhǔn)確預(yù)測(cè)樣本的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)，準(zhǔn)確率可達(dá)到92.3%。這些基因與雌激素代謝、細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)錄等生物學(xué)過(guò)程相關(guān)，可能為犬乳腺癌預(yù)后分子標(biāo)記和治療靶標(biāo)，這將給犬乳腺癌的臨床診斷和治療提供新的思路。

關(guān)鍵詞：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;犬乳腺癌;預(yù)后標(biāo)記;基因芯片

中圖分類(lèi)號(hào)：S829.2 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2014）20-4912-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.036

Screening Prognosis Markers for Canine Mammary Tumor

YE Yun，ZHONG Ying-ying，ZHANG Qian

（College of biological and chemical engineering， Guangxi university of science and technology， Liuzhou 545006， Guangxi，China）

Abstract： As one of the most important prognostic factors in the diagnosis of canine mammary tumor， lymph node metastasis was an early step in metastasis. In order to find out the markers in early stage， 27 microarray data of lymph node metastasis positive or negative samples of canine mammary carcinomas were analyzed. 775 significantly differentially expressed genes were obtained. The univariate analysis using Cox proportional hazards model showed that 38 genes were significantly related with survival. 10-gene classifier obtained by penalized Cox proportional hazards model was used to predict the risk of canine mammary tumor samples. The accuracy was 92.3%. These genes were associated with the pathways of estrogen metabolism， cell differentiation， transcription and so on， and might be prognostic molecular markers and potential therapeutic targets. It will provide a new way for the diagnosis and therapy of canine mammary tumor.

Key words： lymph node metastasis; canine mammary tumor; prognosis marker; microarray

乳腺腫瘤是母犬最常見(jiàn)的腫瘤。在犬乳腺癌中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是臨床診斷的重要指標(biāo)，也是發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的早期事件，伴隨著遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生，往往會(huì)導(dǎo)致犬類(lèi)的死亡[1]。早期檢測(cè)是有效治療乳腺癌并延長(zhǎng)動(dòng)物生存時(shí)間的有效途徑，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生的分子機(jī)制仍然不夠清楚，傳統(tǒng)的病理檢驗(yàn)也難以找到更好的檢測(cè)指標(biāo)。因此，很有必要開(kāi)發(fā)新的生物標(biāo)記來(lái)檢測(cè)早期的犬乳腺癌。乳腺癌轉(zhuǎn)移是多基因參與和調(diào)控的過(guò)程，利用基因芯片技術(shù)可以從全基因組水平了解淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移所發(fā)生的基因表達(dá)變化，從而篩選出與預(yù)后有關(guān)的分子標(biāo)記，為犬乳腺癌的診斷和治療提供更好的理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料

本研究采用的基因芯片數(shù)據(jù)來(lái)自美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的公共數(shù)據(jù)庫(kù)GEO（Gene expression omnibus），編號(hào)為GSE20718，為Affymetrix 公司的Canine Genome 2.0 Array平臺(tái)的芯片，共包含13個(gè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的犬乳腺癌和14個(gè)不轉(zhuǎn)移的犬乳腺癌樣本，生存時(shí)間大于24個(gè)月的樣本有13個(gè)，小于24個(gè)月的有12個(gè)，最短生存時(shí)間為1個(gè)月，有2個(gè)樣本生存時(shí)間缺失。

1.2 ?淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)差異基因的篩選

芯片數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用BRB-ArrayTools（Version4.2.1）軟件包來(lái)進(jìn)行，首先采用倍值過(guò)濾和表達(dá)水平過(guò)濾等方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選：去除兩類(lèi)樣本的基因中位數(shù)值小于2倍、表達(dá)值小于100的數(shù)據(jù)，以獲得質(zhì)量可靠的信號(hào)點(diǎn)，合并相同基因的探針。將通過(guò)過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)的基因進(jìn)行兩樣本非配對(duì)樣本t檢驗(yàn)（P<0.001，F(xiàn)DR<0.01），篩選淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與原位腫瘤之間的差異表達(dá)基因。

1.3 ?生存分析及預(yù)測(cè)

將篩選得到的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異基因作為候選基因，以術(shù)后生存時(shí)間作為生存時(shí)間變量，是否死亡作為生存狀態(tài)，采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型和Wald Statistic，在BRB-ArrayTools中對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行單因素分析，進(jìn)一步篩選出與生存顯著相關(guān)的基因（P<0.001），用Kaplan-Meler法作圖分析這些基因表達(dá)對(duì)術(shù)后生存的影響。在此基礎(chǔ)上，將樣本分成兩組，其中一組為訓(xùn)練組（Training，n=12），另外一組作為驗(yàn)證組（Test，n=13），用懲罰Cox模型對(duì)樣本進(jìn)行生存預(yù)測(cè)。100次隨機(jī)對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)（Log-rank test），采用留一法（Leave-one-out）進(jìn)行驗(yàn)證，獲得小于10個(gè)基因的分類(lèi)器用于預(yù)測(cè)樣本的預(yù)后，將樣本分為低風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)兩組。由于病例樣本中有兩例生存時(shí)間缺失，因此只有25例樣本用于生存分析。另外，生存時(shí)間大于24個(gè)月的樣本在分析中定為24個(gè)月。

1.4 ?基因功能注釋

通過(guò)在線(xiàn)分析工具對(duì)生存分析相關(guān)的基因進(jìn)行基因本體（Gene ontology，GO，www.geneontology.org）注釋?zhuān)⑼ㄟ^(guò)文獻(xiàn)挖掘，找到這些基因相應(yīng)的生物學(xué)功能及其對(duì)應(yīng)的生物學(xué)通路，從而探討這些基因?qū)θ橄侔╊A(yù)后可能存在的影響機(jī)制。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的獲得

通過(guò)初步數(shù)據(jù)過(guò)濾，共有3 507個(gè)基因符合過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)。然后，對(duì)13個(gè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的犬乳腺癌和14個(gè)不轉(zhuǎn)移的犬乳腺癌樣本進(jìn)行隨機(jī)方差模型的兩樣本t檢驗(yàn)，轉(zhuǎn)移/不轉(zhuǎn)移的兩組樣本間表達(dá)倍數(shù)大于2的探針為差異表達(dá)基因，按此標(biāo)準(zhǔn)獲得了775個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因496個(gè)，下調(diào)基因201個(gè)。

2.2 ?生存相關(guān)基因的獲得

合并共同基因的探針，將上述獲得的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異基因用于生存分析。由于只將樣本分為兩個(gè)樣本組，因此，在Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型用24個(gè)月作為分界點(diǎn)?；虮磉_(dá)的單因素分析得到38個(gè)與術(shù)后生存顯著相關(guān)的基因（P<0.001），其中10個(gè)基因在預(yù)后好的樣本中高表達(dá)，28個(gè)基因在預(yù)后差的樣本中高表達(dá)。

2.3 ?生存預(yù)測(cè)及相關(guān)基因功能注釋

經(jīng)過(guò)100次隨機(jī)Log-rank test，留一法進(jìn)行交叉檢驗(yàn)，從生存相關(guān)的基因中篩選到10個(gè)基因的分類(lèi)器，Kaplan-Meler生存曲線(xiàn)表明，分類(lèi)器可以將樣本分為高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)兩個(gè)組（P<0.05，圖1）。由于在分析中只分兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)組，因此，構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)分組的預(yù)后指數(shù)百分?jǐn)?shù)為50，樣本的預(yù)后指數(shù)大于1即為高風(fēng)險(xiǎn)，反之小于1則為低風(fēng)險(xiǎn)。

對(duì)Test組的生存預(yù)測(cè)結(jié)果如表1所示，13個(gè)樣本中低風(fēng)險(xiǎn)樣本有7個(gè)，另外的6個(gè)樣本則被預(yù)測(cè)為高風(fēng)險(xiǎn)。低風(fēng)險(xiǎn)樣本的實(shí)際術(shù)后生存時(shí)間均超過(guò)24個(gè)月，而高風(fēng)險(xiǎn)樣本中除了GSM520212的實(shí)際術(shù)后生存時(shí)間超過(guò)24個(gè)月之外，其他5個(gè)樣本的術(shù)后生存時(shí)間均不到10個(gè)月，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)到92.3%。如表2所示，經(jīng)過(guò)基因本體分析（GO），分類(lèi)器的10個(gè)基因中，只有LOC611412功能未知。其余的9個(gè)基因中，SULT1E1與雌激素活化有關(guān)，F(xiàn)ST參與細(xì)胞分化和卵泡刺激素的負(fù)調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程，GTF2A2和MITF都與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)，ETFDH和LOC475273則與氧化應(yīng)激、電子傳遞等生物學(xué)功能有關(guān)。

3 ?討論

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與犬乳腺癌的預(yù)后關(guān)系密切，本研究用生物信息學(xué)的手段從淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的差異基因中篩選出38個(gè)與犬乳腺癌生存顯著相關(guān)的基因，由此篩選出的10個(gè)基因分子分類(lèi)器能比較準(zhǔn)確預(yù)測(cè)犬乳腺癌病例的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)，準(zhǔn)確率達(dá)到92.3%。這些基因與細(xì)胞分化、雌激素代謝及轉(zhuǎn)錄等生物學(xué)過(guò)程相關(guān)，可作為犬乳腺癌預(yù)后分子標(biāo)記的候選基因。其中，SULT1E1為硫酸基轉(zhuǎn)移酶（Sulfotransferases，SULTs）SULT1家族的主要成員之一，是目前所發(fā)現(xiàn)的13種同功酶中對(duì)雌激素催化作用最強(qiáng)的酶[2]。有研究指出SULT1E1基因表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致雌激素依賴(lài)性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，可作為獨(dú)立的判斷乳腺癌預(yù)后的指標(biāo)[3]。本研究通過(guò)基因表達(dá)的單因素生存分析結(jié)果也表明，SULT1E1基因在預(yù)后差的樣本（n=12）中低表達(dá)，而在生存期大于24個(gè)月的樣本中均高表達(dá)（n=13）。作為重要的解毒酶類(lèi)，SULT1E1可以將PAPS的硫酸根轉(zhuǎn)移至雌激素的3-羥基上，形成水溶型無(wú)活性硫酸化雌激素，從而降低循環(huán)及靶組織中雌激素暴露水平[4]。乳腺癌是雌激素依賴(lài)性腫瘤，SULT1E1基因低表達(dá)會(huì)使雌激素活性增加，從而增加乳腺組織暴露于雌激素的機(jī)會(huì)增加。FST是編碼的蛋白是一種單鏈糖蛋白，在腦、乳腺、腎臟等組織中均有表達(dá)，在卵巢組織中濃度最高[5]。FST的高表達(dá)有利于卵巢癌的治療。FST的表達(dá)受到一個(gè)BRCA1基因的調(diào)控，高水平的BRCA1可提高FST的表達(dá)[6]。BRCA1被認(rèn)為是一種乳腺癌的抑癌基因，編碼一種DNA結(jié)合蛋白，在正常乳腺上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄中起重要調(diào)控作用，抑制細(xì)胞進(jìn)入增殖周期[7]?；虮磉_(dá)譜分析表明，F(xiàn)ST在預(yù)后好的犬乳腺癌樣本（n=13）中高表達(dá)，這表明可能在預(yù)后好的樣本中BRCA1存在一定的表達(dá)量。由于BRCAl蛋白表達(dá)缺失與乳腺癌惡性程度、預(yù)后差有一定關(guān)系[8]，因而B(niǎo)RCA1的表達(dá)有利于乳腺癌的預(yù)后。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多個(gè)基因共同作用的過(guò)程，高通量的基因表達(dá)譜分析可以從全基因組水平較為全面了解腫瘤發(fā)生的機(jī)制。利用高通量方法篩選犬乳腺癌的預(yù)后分子標(biāo)記，可為動(dòng)物乳腺癌乃至人乳腺癌的臨床診斷和治療提供了更加豐富的研究手段。

參考文獻(xiàn)：

[1] BENJAMIN S A， LEE A C， SAUNDERS W J.Classification and behavior of canine mammary epithelial neoplasms based on life-span observations in beagles[J]. Vet Pathol 1999， 36（5）： 423-436.

[2] GAMAGE N， BARNETT A， HEMPEL N， et al. Human sulfotransferases and their role in chemical metabolism[J]. Toxicol Sci， 2006， 90（1）： 5-22.

[3] SASANO H， NAGASAKI S，MIKI Y，et al. New developments in in tracrinology of human breast cancer： estrogen sulfatase and sulfotransferase[J]. Ann NY Acad Sci，2009，1155：76-79.

[4] 管 ?睿.硫酸基轉(zhuǎn)移酶家族與婦科腫瘤[J].國(guó)際婦產(chǎn)科學(xué)雜志，2011，38（4）：324-327.

[5] LINDSELL C E， MISRA V， MURPHY B D. Regulation of follistatin gene expression in the ovary and in primary cultures of porcine granulosa cells[J]. J Reprod Fertil 1994，100： 591-597.

[6] KARVE T M， PREET A， SNEED R， et al. BRCA1 regulates follistatin function in ovarian cancer and human ovarian surface epithelial cells[J]. PLoS ONE ， 2012，7（6）： e37697.

[7] MLINE R L， ANTONIOU A C.Genetic modifiers of cancer risk for BRCAl and BRCA2 mutation carriers[J]. Aan Oncol， 2011，22（Suppl 1）：11-17.

[8] 趙云霞，龔曉萌，劉德純，等.BRCAl、PTEN、Rb、C-myc和C-myb在乳腺癌中的異常表達(dá)及臨床意義探討[J].中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2012，21（1）：57-62.

[2] GAMAGE N， BARNETT A， HEMPEL N， et al. Human sulfotransferases and their role in chemical metabolism[J]. Toxicol Sci， 2006， 90（1）： 5-22.

[3] SASANO H， NAGASAKI S，MIKI Y，et al. New developments in in tracrinology of human breast cancer： estrogen sulfatase and sulfotransferase[J]. Ann NY Acad Sci，2009，1155：76-79.

[4] 管 ?睿.硫酸基轉(zhuǎn)移酶家族與婦科腫瘤[J].國(guó)際婦產(chǎn)科學(xué)雜志，2011，38（4）：324-327.

[5] LINDSELL C E， MISRA V， MURPHY B D. Regulation of follistatin gene expression in the ovary and in primary cultures of porcine granulosa cells[J]. J Reprod Fertil 1994，100： 591-597.

[6] KARVE T M， PREET A， SNEED R， et al. BRCA1 regulates follistatin function in ovarian cancer and human ovarian surface epithelial cells[J]. PLoS ONE ， 2012，7（6）： e37697.

[7] MLINE R L， ANTONIOU A C.Genetic modifiers of cancer risk for BRCAl and BRCA2 mutation carriers[J]. Aan Oncol， 2011，22（Suppl 1）：11-17.

[8] 趙云霞，龔曉萌，劉德純，等.BRCAl、PTEN、Rb、C-myc和C-myb在乳腺癌中的異常表達(dá)及臨床意義探討[J].中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2012，21（1）：57-62.

[2] GAMAGE N， BARNETT A， HEMPEL N， et al. Human sulfotransferases and their role in chemical metabolism[J]. Toxicol Sci， 2006， 90（1）： 5-22.

[3] SASANO H， NAGASAKI S，MIKI Y，et al. New developments in in tracrinology of human breast cancer： estrogen sulfatase and sulfotransferase[J]. Ann NY Acad Sci，2009，1155：76-79.

[4] 管 ?睿.硫酸基轉(zhuǎn)移酶家族與婦科腫瘤[J].國(guó)際婦產(chǎn)科學(xué)雜志，2011，38（4）：324-327.

[5] LINDSELL C E， MISRA V， MURPHY B D. Regulation of follistatin gene expression in the ovary and in primary cultures of porcine granulosa cells[J]. J Reprod Fertil 1994，100： 591-597.

[6] KARVE T M， PREET A， SNEED R， et al. BRCA1 regulates follistatin function in ovarian cancer and human ovarian surface epithelial cells[J]. PLoS ONE ， 2012，7（6）： e37697.

[7] MLINE R L， ANTONIOU A C.Genetic modifiers of cancer risk for BRCAl and BRCA2 mutation carriers[J]. Aan Oncol， 2011，22（Suppl 1）：11-17.

[8] 趙云霞，龔曉萌，劉德純，等.BRCAl、PTEN、Rb、C-myc和C-myb在乳腺癌中的異常表達(dá)及臨床意義探討[J].中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2012，21（1）：57-62.