賈琨 張曉峰 董宇昊 張巖 馬偉元

轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α在銀屑病皮損中的表達(dá)及意義

賈琨 張曉峰 董宇昊 張巖 馬偉元

目的探討轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(C/EBP-α)在尋常性銀屑病皮損中的表達(dá)及與角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖及皮損嚴(yán)重程度間的相關(guān)性。方法用免疫組化二步法及Western印跡檢測30例尋常性銀屑病患者皮損和30例健康對照皮膚的表皮中C/EBP-α。免疫組化法檢測Ki-67的表達(dá),并根據(jù)Ki-67陽性表達(dá)數(shù)量計(jì)算增殖指數(shù),Pearson相關(guān)分析法分析尋常性銀屑病皮損中C/EBP-α的表達(dá)水平與角質(zhì)形成細(xì)胞Ki-67增殖指數(shù)及銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)(PASI評分)間的相關(guān)性。結(jié)果C/EBP-α主要在角質(zhì)形成細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá),尋常性銀屑病皮損中C/EBP-α的表達(dá)較健康對照皮膚明顯下調(diào)(t=7.82,P＜0.05)。Ki-67主要在角質(zhì)形成細(xì)胞胞核中表達(dá),尋常性銀屑病皮損中角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖指數(shù)明顯高于健康對照皮膚(t=4.54,P＜0.05)。經(jīng)Pearson相關(guān)分析,尋常性銀屑病皮損中C/EBP-α表達(dá)水平與增殖指數(shù)呈負(fù)相關(guān),與PASI評分呈負(fù)相關(guān)。Western印跡結(jié)果亦顯示,C/EBP-α在銀屑病皮損處的表達(dá)量顯著下調(diào)。結(jié)論C/EBP-α在尋常性銀屑病皮損中表達(dá)下調(diào),可能參與了尋常性銀屑病的發(fā)病過程。

銀屑病;CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α;增殖指數(shù)

目前認(rèn)為,銀屑病是遺傳因素與環(huán)境因素等相互作用的多基因病,通過免疫介導(dǎo)的共同通路最后引起角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生增殖。角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖造成的表皮增生肥厚與角化不全是其典型病理特征。轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(C/EBP-α)是一種含亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的基本轉(zhuǎn)錄因子,在機(jī)體多種已分化組織中高度表達(dá)[1]。研究證實(shí),C/EBP-α在表皮各層細(xì)胞中均有表達(dá),參與表皮細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控過程,且與多種皮膚腫瘤的發(fā)病密切相關(guān)[2]。我們用免疫組化技術(shù)檢測C/EBP-α在尋常性銀屑病皮損中表達(dá),分析其與增殖指數(shù)和銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)(PASI)間的相關(guān)性,探討C/EBP-α在尋常性銀屑病發(fā)病機(jī)制中的作用。

一、資料與方法

1.臨床資料:30份蠟塊標(biāo)本均來源于2010—2011年于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院就診并確診為尋常性銀屑病進(jìn)行期患者。其中男16例,女14例,年齡13～45歲,平均年齡27.8歲,病程10 d至9年。30例健康人均無皮膚病,由山東大學(xué)齊魯醫(yī)院皮膚科、醫(yī)療美容科留取皮膚標(biāo)本,制成蠟塊后保存,其中男16例,女14例,年齡12～46歲,平均年齡31.8歲,兩組在性別、年齡、取材部位上相匹配,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。PASI按照文獻(xiàn)[3]方法計(jì)算。

2.主要試劑:濃縮型兔抗人C/EBP-α多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司),即用型鼠抗人Ki-67單克隆抗體、二步法免疫組化試劑盒、DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。RIPA裂解液(強(qiáng))、PMSF(碧云天生物技術(shù)研究所)、10%SDS-PAGE預(yù)制膠、ECL試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白(美國Earthox公司)。其他試劑均由山東大學(xué)齊魯醫(yī)院皮膚科實(shí)驗(yàn)室提供。

3.免疫組化方法:所有標(biāo)本均由組織活檢獲得,4%甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋,切片,脫蠟至水,1 mmol/L EDTA抗原修復(fù)液(pH=8.0)進(jìn)行高壓抗原修復(fù)。3%H2O2溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶,山羊血清孵育消除非特異性背景著色。滴加一抗,C/EBP-α濃度為1∶100,Ki-67直接使用,37℃孵育1 h。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗切片3次,滴加二抗,操作步驟按照說明書進(jìn)行。DAB鏡下顯色,蘇木精復(fù)染,鏡檢。

圖1 C/EBP-α在健康對照皮膚和銀屑病皮損處的表達(dá)(免疫組化二步法×200) 1a:C/EBP-α在健康對照皮膚表皮各層均有表達(dá),主要表達(dá)在角質(zhì)形成細(xì)胞胞質(zhì);1b:C/EBP-α在銀屑病皮損處表

圖2 Ki-67在健康對照皮膚和銀屑病皮損處的表達(dá)(免疫組化二步法×200) 2a:健康對照皮膚在表皮基底層有零星表達(dá),Ki-67主要表達(dá)于角質(zhì)形成細(xì)胞胞核;2b:銀屑病皮損部位Ki-67在基底層和棘層中下部見廣泛表達(dá)

4.Western印跡:健康對照皮膚組織和銀屑病皮損組織加入含1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液,經(jīng)玻璃勻漿器勻漿直至充分裂解。14 000×g離心5 min,取上清,BCA法測定蛋白濃度。30 μg裂解產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE垂直電泳(濃縮膠100 V、分離膠200 V)后以1 mA/cm2半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)到PVDF膜上。PVDF膜以5%脫脂奶粉封閉1 h,兔抗人C/EBP-α多克隆抗體4℃孵育過夜(工作濃度1∶400),TBST(含0.1%吐溫20的0.01 mol/L的Tris緩沖溶液)充分漂洗后,辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白(工作濃度1∶1 000)孵育1 h。采用ECL試劑盒顯色,X線片曝光成像,以目的蛋白與β肌動(dòng)蛋白的灰度比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

5.免疫組化結(jié)果判定:C/EBP-α以胞質(zhì)出現(xiàn)黃色至棕黃色顆粒狀物質(zhì)為染色陽性,表達(dá)水平以灰度值表示,灰度值越高,陽性程度越低,反之亦然。使用ToupCam顯微攝像系統(tǒng)拍攝圖片,每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取3個(gè)視野,通過photoshop16.0軟件計(jì)算灰度值。Ki-67以胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色至棕黃色顆粒狀物質(zhì)為陽性。增殖指數(shù)的計(jì)算參見文獻(xiàn)[4]。400倍鏡下選取染色陽性最強(qiáng)的“熱點(diǎn)”區(qū)域,計(jì)數(shù)Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)。增殖指數(shù)(PI)即Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

圖3 健康對照皮膚與銀屑病皮損C/EBP-α蛋白表達(dá)檢測1,2:健康對照皮膚;3,4:銀屑病皮損

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果均以±s表示,兩組C/EBP-α免疫組化染色強(qiáng)度、Western印跡結(jié)果及增殖指數(shù)比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),尋常性銀屑病患者C/EBP-α的表達(dá)水平與增殖指數(shù)及PASI間的相關(guān)性分析用Pearson相關(guān)分析。所有結(jié)果均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

1.C/EBP-α表達(dá)水平:C/EBP-α主要在表皮角質(zhì)形成細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá),接近角質(zhì)層其表達(dá)增強(qiáng)(圖1)。經(jīng)灰度掃描分析,健康對照皮膚中C/EBP-α平均灰度值為51.94±7.60,尋常性銀屑病皮損處為85.44±13.88,兩組比較,t=7.82,P＜0.05。

2.Ki-67表達(dá)及增殖指數(shù):Ki-67在尋常性銀屑病組和健康對照皮膚均有表達(dá),但健康對照皮膚中Ki-67陽性細(xì)胞僅位于基底層,為零星表達(dá);尋常性銀屑病皮損中Ki-67陽性細(xì)胞不僅位于基底層,在棘層的中下部也見廣泛表達(dá)(圖2)。健康對照皮膚的增殖指數(shù)為6.60%±2.67%,尋常性銀屑病皮損為20.00%±9.00%,兩組比較,t=4.54,P＜0.05。

3.C/EBP-α表達(dá)與增殖指數(shù)和PASI評分的相關(guān)性:經(jīng)Pearson相關(guān)分析,尋常性銀屑病皮損中角質(zhì)形成細(xì)胞C/EBP-α灰度值與增殖指數(shù)呈正相關(guān)(r=0.65,P＜0.05),與PASI評分呈正相關(guān)(r=0.69,P＜0.05),表明尋常性銀屑病皮損中角質(zhì)形成細(xì)胞C/EBP-α表達(dá)與增殖指數(shù)和PASI評分均呈負(fù)相關(guān)。

4.Western印跡結(jié)果:與健康對照皮膚(1.22±0.17)相比,C/EBP-α在銀屑病皮損中(0.79±0.22)表達(dá)明顯下調(diào)(t=3.42,P＜0.05,圖3)。

三、討論

轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(C/EBP-α)是一種熱穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,包括C/EBP-αp30和C/EBP-αp42兩種蛋白異構(gòu)體,有三個(gè)基本結(jié)構(gòu)域:C端亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域,基本DNA結(jié)合區(qū)域,N端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域[1-2]。C/EBP-α在人體肝臟、呼吸道上皮、脂肪組織等多種器官和組織中表達(dá),在細(xì)胞能量代謝、炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用,參與控制細(xì)胞分化,并通過與多種細(xì)胞周期蛋白相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖過程[5-6]。胚胎期表皮,C/EBP-α主要表達(dá)在分化的上皮層,并隨細(xì)胞分化表達(dá)逐漸增強(qiáng),提示其參與調(diào)控表皮發(fā)生中角質(zhì)形成細(xì)胞分化[7]。Maytin和Habener[5]研究發(fā)現(xiàn),C/EBP-α在棘層中部角質(zhì)形成細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá),并在棘層上部、顆粒層及角質(zhì)層表達(dá)逐漸加強(qiáng),表明參與調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞分化。C/EBP-α作為一種抑癌基因,其蛋白產(chǎn)物通過控制細(xì)胞周期進(jìn)程而調(diào)控細(xì)胞增殖,C/EBP-α表達(dá)下調(diào),加劇腫瘤細(xì)胞增殖失控及腫瘤發(fā)展,而C/EBP-α在這些細(xì)胞中的重新表達(dá)或表達(dá)加強(qiáng)則能抑制細(xì)胞增殖[2,8-9]。由此說明,C/EBP-α能夠調(diào)控包括角質(zhì)形成細(xì)胞的多種類型細(xì)胞的分化,并抑制其增殖。

C/EBP-α調(diào)控細(xì)胞增殖分化的機(jī)制尚不明確,目前認(rèn)為,C/EBP-α能夠調(diào)節(jié)、穩(wěn)定、活化細(xì)胞周期蛋白抑制物p21或直接抑制CDK2和CDK4活性,抑制E2F介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄過程等,阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程,抑制細(xì)胞增殖[10-12]。研究表明,Ras能夠抑制C/EBP-α表達(dá),而c-myc則被證明為C/EBP-α的作用靶點(diǎn)[13]。還有研究表明,尋常性銀屑病皮損中與GTP結(jié)合的ras蛋白增加,活性顯著增高;c-myc表達(dá)顯著增強(qiáng)可能與尋常性銀屑病皮損中存在角質(zhì)形成細(xì)胞增殖分化異常及細(xì)胞周期調(diào)控紊亂有關(guān)[14]。本研究發(fā)現(xiàn),與健康皮膚比較,尋常性銀屑病皮損中C/EBP-α表達(dá)明顯下調(diào),增殖指數(shù)顯著升高。C/EBP-α在尋常性銀屑病皮損中表達(dá)下調(diào)可能與角質(zhì)形成細(xì)胞分化異常及過度增殖相關(guān)。

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2013-07-19)

(本文編輯:吳曉初)

Expression of the transcription factor CCAAT/enhancer-binding protein alpha in psoriatic lesions and its significance

Jia Kun*,Zhang Xiaofeng,Dong Yuhao,Zhang Yan,Ma Weiyuan.*Shandong University School of Medicine,Jinan 250012,China

Ma Weiyuan,Email:dermatologyqlh@163.com

ObjectiveTo detect the expression of the transcription factor CCAAT/enhancer-binding protein alpha(C/EBP-α)in the epidermis of psoriasis vulgaris lesions,and to investigate its correlation with abnormal keratinocyte proliferation and disease severity.MethodsBiopsy specimens were obtained from the lesions of 30 patients with psoriasis vulgaris and normal skin of 30 healthy human controls.A two-step immunohistochemical procedure was performed to detect the expressions of C/EBP-α and Ki-67 in these specimens,and Western blot to quantify the expression of C/EBP-α.The proliferation index of keratinocytes was calculated according to the expression intensity of Ki-67.Statistical analysis was carried out by using the SPSS 17.0 software,and Pearson correlation analysis was conducted to assess the relationship of C/EBP-α expression level with proliferation index of keratinocytes and psoriasis area and severity index(PASI)score.ResultsC/EBP-α was predominantly expressed in the cytoplasm of keratinocytes,while Ki-67 in the nuclei of keratinocytes.Compared with the normal skin,the psoriatic lesions showed a significantly lower expression of Ki-67(t=7.82,P＜0.05),but higher proliferation index of keratinocytes(t=4.54,P＜ 0.05).The expression level of C/EBP-α was negatively correlated with the proliferation index of keratinocytes and PASI score in the patients(bothP＜0.05).Western blot also showed an obvious decrease in the expression of C/EBP-α in psoriatic lesions.ConclusionsThe expression of C/EBP-α is decreased in lesions of psoriasis vulgaris,which might be involved in the pathogenesis of psoriasis vulgaris.

Psoriasis;CCAAT-enhancer-binding protein-alpha;Proliferation index

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.07.017

國家自然科學(xué)基金(81071291);山東省自然科學(xué)基金(Y2007C003)

250012濟(jì)南,山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院(賈琨、張曉峰、董宇昊、張巖);山東大學(xué)齊魯醫(yī)院皮膚科(馬偉元)

馬偉元,Email:dermatologyqlh@163.com