相風(fēng)梅 魏志平 鐘連生 楊青 劉彥群

·論著·

阿維A對HaCaT細(xì)胞體外凋亡和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7及血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響

相風(fēng)梅 魏志平 鐘連生 楊青 劉彥群

目的探討阿維A對HaCaT細(xì)胞體外凋亡和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7(IGFBP7)及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) 表達(dá)的影響。方法將10-5、10-6、10-7、10-8mol/L的阿維A分別作用于HaCaT細(xì)胞24、48、72 h后,采用CCK8法檢測細(xì)胞增殖情況;流式細(xì)胞儀檢測阿維A對HaCaT細(xì)胞凋亡率的影響;Western印跡和RT-PCR法檢測阿維A對HaCaT細(xì)胞IGFBP7、VEGF蛋白及其mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果10-8mol/L阿維A處理HaCaT細(xì)胞48 h時表現(xiàn)出對細(xì)胞增殖的抑制作用,隨著時間延長和藥物濃度升高,抗增殖作用亦增強(qiáng),當(dāng)藥物濃度增加到10-5mol/L時,48 h和72 h的抑制率分別為39.94%±2.27%和49.77%±1.87%。與對照組相比,10-5mol/L阿維A作用48 h后,凋亡率由1.803%±0.313%(對照組)上升至7.617%±0.767%(阿維A組)(P＜0.05),IGFBP7的表達(dá)由0.436±0.013上升至0.939±0.040(P＜0.05),IGFBP7 mRNA的表達(dá)由0.190±0.056上升至0.872±0.079(P＜0.05),VEGF的表達(dá)由0.798±0.036下降至0.213±0.032(P＜0.05),VEGF mRNA的表達(dá)由0.933±0.054下降至0.274±0.041(P＜0.05)。結(jié)論阿維A可促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的體外凋亡,并可在蛋白及mRNA水平上調(diào)IGFBP7及下調(diào)VEGF的表達(dá)。

阿維A;細(xì)胞凋亡;胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白質(zhì)類;血管內(nèi)皮生長因子;HaCaT細(xì)胞

胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7(insulin-like growth factor binding protein 7,IGFBP7)是一種廣泛分布于正常人體組織器官的分泌性糖蛋白,在多種組織細(xì)胞的增殖、分化、衰老、凋亡、癌變等病理生理過程中起重要作用,可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長[1]。阿維A是治療銀屑病療效較好的第2代維A酸類藥物,其藥理作用主要為抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)其分化及凋亡,并具有免疫調(diào)節(jié)作用。本實驗研究了阿維A對HaCaT細(xì)胞體外凋亡及IGFBP7和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的影響,初步探討阿維A治療銀屑病可能的新的作用機(jī)制。

材料與方法

一、試劑和儀器

阿維A(acitretin)由重慶華邦制藥股份有限公司提供,RPMI 1640培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品,胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品,兔抗人IGFBP7多克隆抗體為美國Abcam公司產(chǎn)品,鼠抗人VEGF單克隆抗體、鼠抗人β肌動蛋白單克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、馬抗小鼠IgG抗體均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品,BCA試劑盒為碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品,RT-PCR引物設(shè)計合成于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品,Annexin-V-FITC凋亡檢測試劑盒為北京寶賽生物公司產(chǎn)品,流式細(xì)胞儀為美國Becton Dickinson公司產(chǎn)品。人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞購自上海復(fù)祥生物科技有限公司。阿維A以二甲基亞砜(DMSO)配制成濃度為10-1mol/L儲存液(DMSO濃度≤1‰),-20℃避光保存,用時用培養(yǎng)液稀釋。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組:HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中,置于37℃ 5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞長成致密單層后,以含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞,接種于培養(yǎng)瓶內(nèi),置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h貼壁后,更換無血清、無雙抗RPMI 1640培養(yǎng)液,加入不同濃度阿維A,48 h后進(jìn)行各種指標(biāo)檢測。試驗分為:10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L 阿維 A 組及只加RPMI 1640培養(yǎng)液的對照組。

2.CCK8法檢測HaCaT細(xì)胞增殖抑制率:取HaCaT細(xì)胞3×103/ml接種于96孔培養(yǎng)板,每孔100 μl,培養(yǎng)24 h,細(xì)胞貼壁后,各實驗組按上述設(shè)計分別加入不同濃度的阿維A,并增設(shè)與10-5mol/L阿維A組所含等體積DMSO為溶媒組。每組設(shè)6個復(fù)孔,分別培養(yǎng)24、48、72 h后終止培養(yǎng),棄去原培養(yǎng)基,按新鮮無抗、無血清RPMI 1640培養(yǎng)液與CCK8比例為10∶1混勻,每孔加入100 μl混勻液,于培養(yǎng)箱中孵育2 h,酶標(biāo)儀測定450 nm波長處每孔的吸光度(A值),實驗重復(fù)3次,計算細(xì)胞增殖抑制率,抑制率=(1-給藥組A值/對照組A值)×100%。

3.流式細(xì)胞儀Annexin V/PI檢測HaCaT細(xì)胞早期及中晚期總凋亡率:以每孔1×105細(xì)胞接種于6孔板內(nèi),24 h后按上述分組用不同濃度阿維A處理細(xì)胞,每個濃度設(shè)3個復(fù)孔,48 h后以胰酶處理細(xì)胞,約3～5 min后用含血清的培養(yǎng)基終止消化,用4℃預(yù)冷磷酸鹽緩沖液輕輕吹打成單細(xì)胞懸液,4℃ 179×g離心5 min后棄上清,重復(fù)3次,將各組細(xì)胞沉淀分別重懸于200 μl結(jié)合緩沖液,并分別加入10 μl Annexin V-FITC混勻,室溫避光反應(yīng)15 min后,分別加入300 μl結(jié)合緩沖液以及5 μl碘化丙錠(PI)染液,在1 h內(nèi)上機(jī)檢測。

4.Western印跡法檢測HaCaT細(xì)胞IGFBP7及VEGF的表達(dá):分組同上,48 h后收集各組細(xì)胞,提取總蛋白,用BCA法檢測蛋白濃度,上樣80 μg進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉,一抗孵育(兔抗人IGFBP7多克隆抗體的工作濃度為1∶1 000,兔抗人VEGF單克隆抗體為1∶200,鼠抗人β肌動蛋白單克隆抗體為1∶500),4℃過夜,二抗孵育(山羊抗兔IgG抗體的工作濃度為1∶500,馬抗小鼠IgG抗體為1∶500)2 h,BCIP/NBT顯色液顯色,凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果,目的蛋白條帶IGFBP7、VEGF與相應(yīng)的內(nèi)參β肌動蛋白條帶的灰度值比值(IGFBP7/β肌動蛋白、VEGF/β肌動蛋白)作為其蛋白水平的半定量指標(biāo)。

5.RT-PCR法檢測HaCaT細(xì)胞IGFBP7、VEGF mRNA的表達(dá):各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,目的基因IGFBP7上游引物:5'-CAGGTGTACTTGAGCTGTGA-3',下游引物:5'-CATGTAAGGCATCAACCACTGT-3',擴(kuò)增片段為286 bp。VEGF上游引物:5'-CATGAACTTTCTGCTG TCTTGG-3',下游引物:5'-GGTCTGCATTCACATTT GTTGT-3',擴(kuò)增片段為396 bp。內(nèi)參β肌動蛋白上游引物:5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3',下游引物:5'-CTGGAAGGT GGACAGCGAGG-3',擴(kuò)增片段為205 bp。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。PCR反應(yīng)體系為25 μl,擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性3 min,94℃變性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸45 s,共35個循環(huán),最后72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,用凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照,檢測各電泳條帶的灰度值,計算與β肌動蛋白比值,得到目的產(chǎn)物的相對含量。

6.統(tǒng)計學(xué)分析:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,計量資料用±s表示。多個均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。相關(guān)分析用Pearson相關(guān)分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、阿維A對HaCaT細(xì)胞體外增殖的影響

結(jié)果見圖1。10-8mol/L阿維A處理的HaCaT細(xì)胞,48 h時對細(xì)胞增殖的抑制作用與對照組相比差異開始有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),故選擇培養(yǎng)48 h為以下實驗的時間段,且隨著時間延長和藥物劑量的加大,抗增殖作用愈明顯,當(dāng)藥物濃度增加到10-5mol/L時,48 h和72 h的抑制率分別為39.94%±2.27%和49.77%±1.87%。與對照組相比,各濃度不同時間段溶媒組對HaCaT細(xì)胞體外增殖的抑制率(24、48、72 h 時分別為 1.53%±0.91%、1.93%±0.82%、2.35%±0.73%)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P＞0.05),故忽略此DMSO實驗劑量對HaCaT細(xì)胞的影響,以下實驗舍棄溶媒組。

二、阿維A對HaCaT細(xì)胞體外凋亡率的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,10-5、10-6、10-7、10-8mol/L阿維A作用HaCaT細(xì)胞48 h后,各實驗組早期及中晚期細(xì)胞總凋亡率分別為7.62%±0.77%、5.39%±0.83%、3.84%±0.62%、3.00%±0.31%,與對照組總凋亡率(1.80%±0.31%)相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),其中以10-5mol/L阿維A組作用最強(qiáng)。

三、阿維A對HaCaT細(xì)胞IGFBP7及其mRNA表達(dá)的影響

結(jié)果見圖2、3及表1。結(jié)果表明,不同濃度阿維A作用于HaCaT細(xì)胞48 h后,與對照組相比,IGFBP7及其mRNA的表達(dá)均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。當(dāng)阿維A濃度增加到10-5mol/L時,IGFBP7/β肌動蛋白灰度比由對照組0.436±0.013上升至0.939±0.040,IGFBP7 mRNA/β肌動蛋白mRNA灰度比由對照組0.190±0.056上升至0.872±0.079,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜ 0.05)。

圖1 阿維A對HaCaT細(xì)胞體外增殖的抑制率

圖2 阿維A對HaCaT細(xì)胞胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7(IGFBP7)表達(dá)的影響 1 ～ 4:分別為 10-5、10-6、10-7、10-8mol/L 阿維A;5:對照組

圖3 阿維A對HaCaT細(xì)胞胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7(IGFBP7)mRNA表達(dá)的影響 1:標(biāo)準(zhǔn)參照物;2～5:分別為10-5、10-6、10-7、10-8mol/L 阿維 A;6:對照組

表1 阿維A對HaCaT細(xì)胞胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7及血管內(nèi)皮生長因子及其mRNA表達(dá)的影響(±s)

表1 阿維A對HaCaT細(xì)胞胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7及血管內(nèi)皮生長因子及其mRNA表達(dá)的影響(±s)

注:n=3。 a:與對照組相比,P＜0.05

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四、阿維A對HaCaT細(xì)胞VEGF及其mRNA表達(dá)的影響

結(jié)果見圖4、5及表1。結(jié)果表明,不同濃度阿維A作用于HaCaT細(xì)胞48 h后,與對照組相比,VEGF及其mRNA的表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05)。當(dāng)阿維A濃度增加到10-5mol/L時,VEGF/β肌動蛋白灰度比由對照組0.798±0.036下降至0.213±0.032,VEGF mRNA/β肌動蛋白 mRNA灰度比由對照組0.933±0.054下降至0.274±0.041,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05)。

圖4 阿維A對HaCaT細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的影響 1 ～ 4:分別為 10-5、10-6、10-7、10-8mol/L 阿維 A;5:對照組

圖5 阿維A對HaCaT細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)mRNA表達(dá)的影響 1～4: 分別為10-5、10-6、10-7、10-8mol/L阿維A;5:對照組;6:標(biāo)準(zhǔn)參照物

五、HaCaT細(xì)胞IGFBP7 mRNA表達(dá)與細(xì)胞凋亡率及VEGF mRNA表達(dá)量相關(guān)性分析

利用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行雙變量相關(guān)分析,結(jié)果顯示,不同濃度阿維A處理后,IGFBP7 mRNA表達(dá)量與HaCaT細(xì)胞凋亡率呈顯著正相關(guān),r=0.96,P＜0.05;與VEGF mRNA表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān),r=-0.94,P＜0.05。

討 論

研究表明,IGFBP7可調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞的增殖、黏附、衰老和血管生成,在多種類型腫瘤中具有抑癌基因的功能[2]。IGFBP7在正常表皮組織中廣泛表達(dá),而在銀屑病患者表皮中表達(dá)下調(diào),經(jīng)UVB治療后其表達(dá)可恢復(fù)正常[3]。Nousbeck等[4]發(fā)現(xiàn),下調(diào)IGFBP7的表達(dá)可顯著促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖,抑制其凋亡,而重組IGFBP7(recombinant IGFBP7,rIGFBP7)則可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡。維A酸類藥物治療銀屑病與其對角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、分化及凋亡等過程的調(diào)控有關(guān)。Torma等[5]認(rèn)為,銀屑病皮損部位的維A酸受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑存在異常,但其與銀屑病發(fā)病機(jī)制的具體關(guān)系尚不清楚。本實驗流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明,不同濃度阿維A均能誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞的凋亡。Western印跡檢測到隨著阿維A濃度的增加,IGFBP7的表達(dá)逐漸升高,且統(tǒng)計學(xué)分析顯示,HaCaT細(xì)胞凋亡率與IGFBP7 mRNA的表達(dá)量呈顯著正相關(guān),即隨著IGFBP7表達(dá)量的升高,對凋亡的誘導(dǎo)作用逐漸增強(qiáng),推測此作用機(jī)制可能為阿維A通過結(jié)合維A酸受體上調(diào)IGFBP7的表達(dá)從而誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。

銀屑病血管生成與促血管生成因子VEGF等表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)[6]。血管內(nèi)皮細(xì)胞包含特異的存儲細(xì)胞器,稱為Weibel-Palade小體(WPB),可運輸炎性及凝血性介質(zhì)至血管腔以對血管加壓素等產(chǎn)生應(yīng)答,蛋白質(zhì)組學(xué)篩查表明,IGFBP7為WPB的一種新的組成部分,這一發(fā)現(xiàn)提示IGFBP7在調(diào)節(jié)血管生成方面有重要作用[7]。研究表明,IGFBP7高表達(dá)可抑制腫瘤組織中新生血管生成,并降低裸鼠皮下移植瘤模型的微血管密度,重組IGFBP7可抑制小鼠肝細(xì)胞癌模型中VEGF誘導(dǎo)的血管形成及其下游效應(yīng)信號分子的表達(dá)[2]。Chen等[2]利用pcDNA3.1-IGFBP7轉(zhuǎn)染小鼠惡性黑素瘤細(xì)胞,證實IGFBP7通過誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞凋亡及下調(diào)VEGF的表達(dá)抑制腫瘤的生長,認(rèn)為IGFBP7抑制血管生成可能是其抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一。研究表明,胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor,IGF)-Ⅰ與其受體結(jié)合時,可通過上調(diào)VEGF的表達(dá)來增加新生血管生成以促進(jìn)腫瘤生長[8],IGFBP7可參與IGF和胰島素等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié),IGFBP7通過與IGF-Ⅰ競爭性結(jié)合其受體以調(diào)節(jié)體液及腫瘤組織中IGF-Ⅰ的濃度,從而減少VEGF的合成來實現(xiàn)其調(diào)控腫瘤組織中血管生成的作用[9]。

有研究表明,維A酸對VEGF有一定的調(diào)節(jié)作用[9],但其具體的調(diào)控途徑尚不清楚。本實驗發(fā)現(xiàn),阿維A能夠上調(diào)HaCaT細(xì)胞IGFBP7及mRNA的表達(dá),并下調(diào)VEGF及mRNA的表達(dá)。統(tǒng)計學(xué)分析顯示,隨著阿維A濃度的增加,IGFBP7及其mRNA表達(dá)量逐漸升高,VEGF及其mRNA表達(dá)量逐漸下調(diào),表明阿維A對IGFBP7及VEGF有調(diào)控作用。本實驗只是初步探討阿維A治療銀屑病可能的作用機(jī)制,存在一定的局限性,有待于進(jìn)一步研究。

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2013-11-04)

(本文編輯:顏艷)

In vitroeffects of acitretin on the apoptosis and expressions of insulin-like growth factor binding protein 7 and vascular endothelial growth factor in HaCaT cells

Xiang Fengmei*,Wei Zhiping,Zhong Liansheng,Yang Qing,Liu Yanqun.*Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College,Xuzhou 221002,Jiangsu,China

Wei Zhiping,Email:xzwzp1961@aliyun.com

ObjectiveTo investigate thein vitroeffects of acitretin on the apoptosis and expressions of insulin-like growth factor binding protein 7(IGFBP7)and vascular endothelial growth factor(VEGF)in HaCaT cells.MethodsCultured HaCaT cells were treated with various concentrations(10-5,10-6,10-7,10-8mol/L)of acitretin for various durations,with those cultured in acitretin-free medium serving as the control group.Then,CCK-8 assay was performed to evaluate the proliferation of cells after 24-,48-and 72-hour treatment,flow cytometry to detect the apoptosis of HaCaT cells,and Western blot and reverse transcription-PCR to quantify the protein and mRNA expressions of IGFBP7 and VEGF in HaCaT cells,respectively,after 48-hour treatment.Statistical analysis was carried out by one-way analysis of variance and Pearson correlation analysis.ResultsThe proliferation of HaCaT cells was inhibited by the treatment with acitretin,and the inhibitory effect increased with the elevation of concentration and prolongation of treatment duration of acitretin.A significant decrease was observed in the proliferative activity of HaCaT cells treated with acitretin of 10-8mol/L for 48 hours,and when the concentration of acitretin was 10-5mol/L,the proliferation of HaCaT cells was inhibited by 39.94%±2.27%and 49.77%±1.87%at 48 and 72 hours respectively,compared with the control cells.The HaCaT cells treated with acitretin of 10-5mol/L for 48 hours showed a significant elevation in apoptosis rate(7.617%±0.767%vs.1.803%±0.313%,P＜0.05),IGFBP7 protein and mRNA expressions(0.939±0.040 vs.0.436±0.013,0.872±0.079 vs.0.190±0.056,bothP＜0.05),but a significant reduction in VEGF protein and mRNA expressions(0.213±0.032 vs.0.798±0.036,0.274±0.041 vs.0.933±0.054,bothP＜0.05)in comparison to the control cells.ConclusionsAcitretin can induce the apoptosis of HaCaT cells,and up-regulate IGFBP7 but down-regulate VEGF expressions in HaCaT cells at protein and mRNA levels.

Acitretin;Apoptosis;Insulin-like growth factor binding proteins;Vascular endothelial growth factors;HaCaT cells

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.07.012

221002江蘇,徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科(相風(fēng)梅、魏志平、鐘連生、楊青);江蘇省醫(yī)學(xué)會(劉彥群)

魏志平,Email:xzwzp1961@aliyun.com