刁振琦，李云濤，熊 洋，饒鳳飛，張建民，唐偉躍

(鄭州大學(xué)物理工程學(xué)院，河南 鄭州450001)

肝癌是第5 大常見的惡性腫瘤，占腫瘤致死原因的第3 位，其5 a 自然死亡率超過95%［1］。中國占全世界肝癌病例的45%［2］。因此肝癌在世界各地都極受關(guān)注。肝癌的創(chuàng)痛治療方法是手術(shù)、化療。肝癌的早期發(fā)現(xiàn)對治療后的生存率有極大幫助，因此，探索肝癌的早期診斷有重大意義。本文利用健康人、肝癌患者和肝癌術(shù)后患者的氧合血紅蛋白紫外-可見吸收光譜，研究肝癌的早期診斷。

紫外-可見吸收光譜屬于分子光譜，是由于價(jià)電子的躍遷而產(chǎn)生的。紫外-可見吸收光譜具有以下3點(diǎn)性質(zhì):1)對于同一種物質(zhì)，濃度越大，吸收強(qiáng)度也越大;2)對于同一物質(zhì)，同一濃度待測溶液，對不同波長的吸收強(qiáng)度會呈現(xiàn)出不同的狀況;3)對于同一物質(zhì)，最大吸收峰位置與物質(zhì)的濃度無關(guān)，吸收譜的形狀完全相同［3］。

紫外-可見吸收光譜的應(yīng)用非常廣泛，常見的應(yīng)用是對物質(zhì)進(jìn)行定量分析，對常量、微量、多組分進(jìn)行測定;也可根據(jù)物質(zhì)吸收峰的特性來對進(jìn)行定性分析和結(jié)構(gòu)分析。

血液是有血漿和血細(xì)胞組成。血漿為淺黃色半透明液體，其中除含大量水分外，還含有無機(jī)鹽、白蛋白、球蛋白、酶和各種激素等;血細(xì)胞由人體造血器官產(chǎn)生，分為紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板。紅細(xì)胞有一定的彈性和可塑性，直徑在7 ～8.5 μm 之間，呈雙凹圓盤狀，中央較薄，邊緣較厚。成熟的紅細(xì)胞無細(xì)胞核和細(xì)胞器，里面充滿了血紅蛋白，血紅蛋白是含鐵的蛋白質(zhì)，約占紅細(xì)胞質(zhì)量的33%，具有運(yùn)輸與結(jié)合氧氣和二氧化碳的功能。氧合血紅蛋白是血紅蛋白和氧分子的結(jié)合物，是一種亮紅色的血紅蛋白和氧的化學(xué)合成物，把氧氣運(yùn)輸?shù)饺梭w組織中。

1 試驗(yàn)儀器與材料

儀器:小型臺式離心機(jī)TGL216G，紫外-可見吸收光譜儀(UV-101，日本Shimadzu 公司)，電子掃描顯微鏡(S-505，荷蘭Philips 公司);電子透射顯微鏡(H-606，日本Hitachi 公司)，便攜式拉曼光譜儀(R-3000TM，美國Ocean Optics 公司)。

血液樣品:30 例健康人、40 例肝癌患者和30 例肝癌術(shù)后患者血液樣本均采集于鄭州大學(xué)人民醫(yī)院和鄭州大學(xué)腫瘤醫(yī)院。

化學(xué)試劑(質(zhì)量分?jǐn)?shù)):硝酸銀(99.8%)，聚乙烯醇(95%)，濃硫酸(98%)，銀棒(99. 9%)，雙氧水(30%)，氨水(28%)，去離子水(18.0 MΩ·cm)，載玻片。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取氧合血紅蛋白 取自健康人、肝癌患者和肝癌術(shù)后患者的新鮮血液樣品每例3 mL，不加任何抗凝劑，在37 ℃室溫中放置1 h 左右使其凝結(jié)。然后用小型臺式離心機(jī)5 000 r·min-1離心5 min，使之分層，提取下層紅細(xì)胞，然后將提取的紅細(xì)胞按體積比為1∶10 加入到去離子水中，使之溶血。之后再次使用小型臺式離心機(jī)5 000 r·min-1離心5 min，提取中間溶液即氧合血紅蛋白溶液，放置于冰箱中，0 ～4 ℃保存待測。

2.2 健康人、肝癌和術(shù)后患者氧合血紅蛋白紫外－可見吸收光譜 檢測了30 例健康人、40 例肝癌患者及30 例術(shù)后患者氧合血紅蛋白的紫外-可見吸收光譜。

健康人紫外-可見吸收光譜在413 nm 處出現(xiàn)譜峰，而在肝癌和術(shù)后患者紫外-可見吸收光譜中，此譜峰位置分別平移到了410 nm 和412 nm 處。而在541、576 nm 處沒有出現(xiàn)譜峰平移的情況。健康人、肝癌術(shù)后患者和肝癌患者氧合血紅蛋白紫外-可見吸收光譜在413 nm 譜峰附近強(qiáng)度基本呈現(xiàn)出依次增強(qiáng)的情況;而在541、576 nm 處，健康人、肝癌患者和肝癌術(shù)后患者氧合血紅蛋白紫外-可見吸收光譜譜峰強(qiáng)度基本相同;在413 nm-1附近，肝癌患者紫外-可見吸收光譜的強(qiáng)度普遍要比健康人高很多。見圖1。

在正常生理?xiàng)l件下(37 ℃，pH 7.4)，氧合血紅蛋白在541 nm 和576 nm 處附近有特征吸收峰，吸收峰的高度不僅與紅細(xì)胞內(nèi)氧合血紅蛋白溶液濃度的高低有關(guān)，而且還與血紅蛋白的理化性質(zhì)(如溶解性穩(wěn)定性和氧化狀態(tài)等)有關(guān);吸收峰的位置與不同攜氧能力下氧合血紅蛋白的構(gòu)型有關(guān)［4-5］，413 nm 附近對應(yīng)于血紅蛋白的特征峰。541 nm 和576 nm 特征吸收峰的峰高、峰位和峰形反映了氧合血紅蛋白分子的濃度分子結(jié)構(gòu)的變化及輸氧功能的強(qiáng)弱，吸收峰強(qiáng)弱以及峰行的變化反應(yīng)了氧合血紅蛋白分子機(jī)構(gòu)的變化［4］。在413 nm 處附近，健康人、肝癌患者和術(shù)后患者呈現(xiàn)出明顯不同的光譜強(qiáng)度，肝癌患者紫外-可見吸收光譜的強(qiáng)度普遍要比健康人高很多，肝癌術(shù)后患者也比健康人譜峰強(qiáng)度高，可以表明肝癌患者血液中血紅蛋白的含量可能高于健康人，肝癌術(shù)后患者血紅蛋白含量低于肝癌患者，其血液中血紅蛋白含量在降低。見圖1。

圖1 健康人(黑色)、肝癌(紅色)和肝癌術(shù)后(粉紅色)和紫外-可見吸收光譜

3 討論

實(shí)驗(yàn)中檢測了健康人、肝癌及術(shù)后患者氧合血紅蛋白紫外-可見吸收光譜，分析發(fā)現(xiàn)肝癌及術(shù)后患者氧合血紅蛋白紫外-可見吸收光譜在413 nm 譜峰位置出現(xiàn)平移，分別平移到410 nm 和412 nm 處。健康人、肝癌術(shù)后患者和肝癌患者氧合血紅蛋白紫外-可見吸收光譜在413 nm 譜峰附近強(qiáng)度基本呈現(xiàn)出依次增強(qiáng)的情況;而在541、576 nm 處，健康人、肝癌患者和肝癌術(shù)后患者氧合血紅蛋白紫外-可見吸收光譜譜峰強(qiáng)度基本相同;在413 nm 處附近，肝癌患者紫外-可見吸收光譜的強(qiáng)度普遍要比健康人高很多，肝癌術(shù)后患者也比健康人譜峰強(qiáng)度高，可以表明肝癌患者血液中血紅蛋白的含量可能高于健康人，肝癌術(shù)后患者血紅蛋白含量低于肝癌患者;相對于肝癌患者，肝癌術(shù)后患者血液中血紅蛋白含量在降低。

［1］徐海峰，楊華瑜，張宏冰，等. 改變肝癌早期診斷和治療現(xiàn)狀的新肝癌血清標(biāo)志物［J］. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2008，28(1):104-108.

［2］李根叢，陸才德.肝癌治療的現(xiàn)狀及發(fā)展前景［J］.現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)，2005，17(6):319 -321.

［3］李建軍，丁正生，張海燕.常用判別分類方法分析［J］.西安科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27(1):138 -142.

［4］Tsujita K，Shiraishi T，Kakinuma K. Microspectrophotometry of nitric oxide-dependent changes in hemoglobin in single red blood cells incubatedwith stimulated macrophages［J］. J Biochem，1997，122(2):264 -270.

［5］魏英耐，陳長青，李云濤，等. 不同劑量電子線照射宮頸癌細(xì)胞后紅外光譜的統(tǒng)計(jì)分析［J］.腫瘤基礎(chǔ)與臨床，2013，26(3):216-220.