翟娜娜，黃器偉，陳奎生，劉軍偉，李喜強(qiáng)

(1.黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州450063;2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州450052)

干擾素/維甲酸聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)基因19(gene associated with retinoid-interferon-induced mortality-19，GRIM-19)是GRIMs 家族重要成員之一，是一種由干擾素聯(lián)合全反式維甲酸誘導(dǎo)表達(dá)的新的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)基因［1］。GRIM-19 的正常表達(dá)可以維持細(xì)胞的正常生活周期，使細(xì)胞從衰老進(jìn)入凋亡，低表達(dá)則使某些細(xì)胞不能正常地進(jìn)入細(xì)胞生活周期而凋亡，進(jìn)而引發(fā)腫瘤。本文采用免疫組化S-P 法檢測GRIM-19 蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)，并探討GRIM-19 蛋白與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選擇2012年1月至2013年1月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科手術(shù)切除乳腺癌標(biāo)本50 例及其腫瘤邊緣5 cm 以上的正常乳腺組織50 例?；颊吣挲g在23 ～82 歲，其中＜50 歲23 例，≥50 歲27例;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29 例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21 例;高分化11 例，中分化22 例，低分化17 例;TNM 分期:I、Ⅱ期30 例，Ⅲ、Ⅳ期共20 例。

1.2 試劑 鼠抗人GRIM-19 多克隆抗體、DAB 顯色試劑盒、S-P 試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.3 檢驗(yàn)方法 蛋白檢測采用免疫組化S-P 法進(jìn)行染色，按試劑盒說明書進(jìn)行。用PBS 代替一抗作為陰性對照，用已知的乳腺癌陽性組織切片作為陽性對照。

1.4 結(jié)果判斷 GRIM-19 蛋白在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核著色。參考文獻(xiàn)［2］的免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):在顯微鏡高倍視野下，隨機(jī)觀察5 個(gè)視野，記錄染色陽性的細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞中的百分率:＞50%，3 分;＞25% ～50%，2 分;5% ～25%，1 分;＜5%，0 分。同時(shí)觀察顯色程度:棕褐色，3 分;棕黃色，2 分;淺黃色，l 分;無顯色，0 分。2 項(xiàng)評分相乘，＞6 分為強(qiáng)陽性(+++)，4 ～6分為陽性(++)，2 ～3 分為弱陽性(+)，三者均記為陽性;兩者乘積≤1 分為免疫組化反應(yīng)陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，率的比較用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 GRIM-19 蛋白在不同乳腺組織中的表達(dá)GRIM-19 蛋白在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率為26.00%(13/50)，低于正常乳腺組織中的84. 00%(42/50)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.2 GRIM-19 蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

表1 GRIM-19 蛋白的表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系n(%)

3 討論

GRIM-19 是通過反義基因敲除的方法發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子，由干擾素聯(lián)合維甲酸誘導(dǎo)表達(dá)。Huang 等［3］研究發(fā)現(xiàn)GRIM-19 主要定位于線粒體，可能在細(xì)胞核中微量表達(dá)。本課題發(fā)現(xiàn)GRIM-19 在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中均有表達(dá)，但以細(xì)胞漿表達(dá)為主。在人體多種正常組織中都可以檢測到GRIM-19 蛋白的表達(dá)，并且存在顯著的組織差異性［1-4］。GRIM-19 是細(xì)胞凋亡通路上的一個(gè)環(huán)節(jié)，可能在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上發(fā)揮致凋亡效應(yīng)，其正常表達(dá)能夠維持細(xì)胞正常的生活周期，而突變或低表達(dá)則導(dǎo)致細(xì)胞的變異及惡化。Gong 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，直腸癌組織中GRIM-19 蛋白低表達(dá)，并與結(jié)腸癌臨床分期、分化程度相關(guān)，說明GRIM-19 與直腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。在肺癌［6］、甲狀腺癌［7］、前列腺癌［8］、宮頸癌［9］等腫瘤相關(guān)研究也得到相似結(jié)果。

本文結(jié)果顯示，GRIM-19 蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)水平明顯低于正常乳腺組織，低分化乳腺癌組織中GRIM-19 蛋白表達(dá)明顯低于高分化組織，晚期乳腺癌患者明顯低于早期患者。提示GRIM-19 表達(dá)降低可能與乳癌的發(fā)生發(fā)展及惡性程度有關(guān)，GRIM-19 蛋白的低表達(dá)或缺失是導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生的重要原因。

［1］Angell JE，Lindner DJ，Shapiro PS，et al. Identification of GRIM-19，a novel cell death-regulatory gene induced by the interferon-beta and retinoic acid combination，using a genetic approach［J］. J Biol Chem，2000，275(43):33416 -33426.

［2］Wilentz RE，Su GH，Dai JL，et al.Immunohistochemical labeling for dpc4 mirrors genetic status in pancreatic adenocarcinomas :a new marker of DPC4 inactivation［J］. Am J Pathol，2000，156(1):37-43.

［3］Huang G，Lu H，Hao A，et al.GRIM-19，a cell death regulatory protein，is essential for assembly and function of mitochondrial complex I［J］.Mol Cell Biol，2004，24(19):8447 -8456.

［4］Chidambaram NV，Angell JE，Ling W，et al.Chromosomal localization of human GRIM-19，a novel IFN-beta and retinoic acid-activated regulator of cell death［J］.J Interferon Cytokine Res，2000，20(7):661 -665.

［5］Gong LB，Luo XL，Liu SY，et al. Correlations of GRIM-19 and its target gene product STAT3 to malignancy of human colorectal carcinoma［J］.Ai Zheng，2007，26(7):683 -687.

［6］周愛民，趙繼京，葉靜，等.GRIM-19 蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義［J］.癌癥，2009，28(4):431 -435.

［7］Kimura ET，Nikiforova MN，Zhu Z，et al.High prevalence of BRAF mutations in thyroid cancer:genetic evidence for constitutive activation of the RET/PTC-RAS-BRAF signaling pathway in papillary thyroid carcinoma［J］.Cancer Res，2003，63(7):1454 -1457.

［8］Gao AC，Lou W，Ichikawa T，et al.Suppression of the tumorigenicity of prostatic cancer cells by gene(s)located on human chromosome 19p13.1-13.2［J］.Prostate，1999，38(1):46 -54.

［9］Zhou Y，Li M，Wei Y，et al. Down-regulation of GRIM-19 expression is associated with hyperactivation of STAT3-induced gene expression and tumor growth in human cervical cancers［J］. J Interferon Cytokine Res，2009，29(10):695 -703.