樊玉霞，劉 洋，劉 征，王曉明，袁青領(lǐng)，盧秀波

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院甲狀腺外科，河南 鄭州450052)

甲狀腺髓樣癌(medullary thyroid carcinoma，MTC)占甲狀腺癌的5% ～10%，起源于甲狀腺濾泡旁細(xì)胞［1］。據(jù)報(bào)道，MTC 預(yù)后較差，超過50%的MTC 患者就診時(shí)已有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，5 a 生存率為25%，10 a生存率為10%，嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命。目前MTC 發(fā)病機(jī)制尚不清楚，探索其發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵致病因素，尋找早期診斷的腫瘤標(biāo)志物及有效的分子治療靶點(diǎn)對MTC 的早期診斷及治療至關(guān)重要。YAP 蛋白是調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡的重要蛋白，在多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要促進(jìn)作用［2］。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測YAP 蛋白在MTC 組織中的表達(dá)，初步探討YAP 蛋白在MTC 組織中的表達(dá)情況及意義，為MTC 的診斷和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 臨床資料及主要試劑 50 例甲狀腺組織標(biāo)本均選自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2012年5月至2014年5月隨訪資料完整的手術(shù)切除標(biāo)本，其中包括25 例MTC(男9 例，女16 例，年齡17 ～66 歲，中位年齡49 歲)和25 例正常甲狀腺組織(男10 例，女15 例，年齡16 ～69 歲，中位年齡48 歲)。所有MTC 患者術(shù)前未經(jīng)過任何抗腫瘤治療。所有標(biāo)本均得到2 位以上的病理學(xué)專家證實(shí)。標(biāo)本獲取后均常規(guī)質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋制片。實(shí)驗(yàn)用兔抗人YAP 蛋白單克隆抗體購于美國Santa Cruz Biotechnology 公司，HRP 標(biāo)記的抗兔鼠通用型Polymer Kit 和DAB 酶底物顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組織化學(xué)方法檢測YAP 蛋白在MTC 和正常甲狀腺組織中的表達(dá)。切片經(jīng)過二甲苯常規(guī)脫蠟，梯度酒精和蒸餾水水化后，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3% H2O2孵育15 min 封閉內(nèi)源性過氧化物酶，并用EDTA 進(jìn)行抗原修復(fù)。加兔抗人YAP 單克隆抗體(工作濃度1∶100)孵育，4 ℃過夜。PBS 緩沖液清洗3 次，每次5 min。加入HRP 標(biāo)記的二抗，室溫孵育20 min，PBS 緩沖液清洗3 次，每次5 min。DAB 顯色2 ～5 min，蘇木素輕度復(fù)染，沖洗。中性樹膠封片。以PBS 緩沖液替代一抗為陰性對照。

1.3 免疫組化的結(jié)果判定 陽性細(xì)胞數(shù)聯(lián)合染色強(qiáng)度進(jìn)行評分，采用半定量積分法判斷結(jié)果。陽性細(xì)胞數(shù):≤5%為0 分，＞5% ～25%為1 分，＞25% ～50%為2 分，＞50% ～75%為3 分，＞75%為4 分;陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度:無色為0 分，淺黃色為1 分，黃色為2 分，深黃或棕褐色為3 分。將2 項(xiàng)積分相乘為最終評分，＜4 分為陰性表達(dá)，≥4 分為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

25 例MTC 組織中YAP 蛋白陽性表達(dá)率為88.00%(22/25)，陽性信號主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿，染色程度主要為中等或強(qiáng)陽性;而25 例正常甲狀腺組織中YAP 蛋白表達(dá)均為陰性，2 組YAP 蛋白陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 39. 286，P ＜0.05)。見圖1。

圖1 YAP 蛋白在MTC 組織中的表達(dá)(200 ×)(A、B、C)

3 討論

MTC 的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟、多階段的復(fù)雜過程，與細(xì)胞的增殖、凋亡等密切相關(guān)。然而目前為止，MTC 發(fā)病機(jī)制尚不清楚，從分子水平對MTC的發(fā)生進(jìn)展進(jìn)行研究，對于該惡性腫瘤的診治及預(yù)防具有重要意義。各種腫瘤發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)是癌基因激活和抑癌基因的突變或失活，YAP 是細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)通路上的重要基因，有報(bào)道稱當(dāng)YAP 基因突變時(shí)，將使細(xì)胞異常增生而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，因此YAP 被稱為是一種候選的癌基因。

YAP 蛋白是Hippo 信號通路中的核心成員，該通路主要調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡，在胚胎發(fā)育及器官形成過程中起著重要作用［3］。Hippo 信號通路激活時(shí)，YAP被磷酸化，不能發(fā)揮生物學(xué)作用，當(dāng)Hippo 信號通路受到抑制時(shí)，YAP 蛋白不被磷酸化，可以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而激活下游基因，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄［4］。YAP 在多種惡性腫瘤中呈明顯過表達(dá)。Tsujiura 等［5］的研究顯示YAP 在子宮內(nèi)膜癌組織中呈過表達(dá)，且抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中YAP 的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞生長。Perra等［6］通過構(gòu)建動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)，在肝癌發(fā)生早期即可出現(xiàn)YAP 過表達(dá)，并可作為肝癌潛在的治療靶點(diǎn)。Avruch 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，YAP 可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及有望成為治療結(jié)腸癌新靶點(diǎn)。此外，Xia 等［8］報(bào)道YAP 可以促進(jìn)卵巢上皮細(xì)胞向間質(zhì)演變，進(jìn)而促使卵巢癌細(xì)胞生長和腫瘤的生成。本研究發(fā)現(xiàn)YAP 蛋白在MTC 組織中呈明顯過表達(dá)，表明YAP 與MTC 蛋白的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但其具體的調(diào)控機(jī)制不清楚，尚有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，YAP 蛋白在MTC 組織中呈過表達(dá)，表明YAP 蛋白可能與MTC 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有望成為具有潛在應(yīng)用價(jià)值的分子標(biāo)記及治療靶點(diǎn)。但是YAP 蛋白在MTC 發(fā)生發(fā)展中的具體作用及機(jī)制還不明確，深入研究YAP 蛋白信號通路與MTC 的關(guān)系將是我們下一步研究的重點(diǎn)。

［1］Maia AL，Siqueira DR，Kulcsar MA，et al.Diagnosis，treatment，and follow-up of medullary thyroid carcinoma:recommendations by the Thyroid Department of the Brazilian Society of Endocrinology and Metabolism［J］. Arq Bras Endocrinol Metabol，2014，58(7):667-700.

［2］Kim SK，Jung WH，Koo JS. Expression of Yes-associated protein(YAP)in breast phyllodes tumor［J］.Int J Clin Exp Pathol，2014，7(9):5997 -6005.

［3］Tariki M，Dhanyamraju PK，F(xiàn)endrich V，et al. The Yes-associated protein controls the cell density regulation of Hedgehog signaling［J］.Oncogenesis，2014，3:e112.

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［5］Tsujiura M，Mazack V，Sudol M，et al. Yes-associated protein(YAP)modulates oncogenic features and radiation sensitivity in endometrial cancer［J］.PLoS One，2014，9(6):e100974.

［6］Perra A，Kowalik MA，Ghiso E，et al.YAP activation is an early event and a potential therapeutic target in liver cancer development［J］.J Hepatol，2014，61(5):1088 -1096.

［7］Avruch J，Zhou D，Bardeesy N. YAP oncogene overexpression supercharges colon cancer proliferation［J］.Cell Cycle，2012，11(6):1090 -1096.

［8］Xia Y，Chang T，Wang Y，et al.YAP promotes ovarian cancer cell tumorigenesis and is indicative of a poor prognosis for ovarian cancer patients［J］.PLoS One，2014，9(3):e91770.