黃邵洪，覃 杰，李 昀，安 軍，張軍航，榮 健

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院1.胸心外科、2.放射科，廣東廣州 510630;3.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州 510089)

肺癌已成為全球首位死因，其中80%為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)［1］。盡管在晚期NSCLC治療領(lǐng)域近年來取得了較大進(jìn)展，但針對(duì)其發(fā)病機(jī)制仍知之甚少。

通常認(rèn)為機(jī)體的腫瘤監(jiān)視體系在預(yù)防腫瘤發(fā)生、發(fā)展中扮演重要的角色。腫瘤抗原特異性CD4+T淋巴細(xì)胞和細(xì)胞毒性CD8+T淋巴細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤免疫細(xì)胞，是構(gòu)成機(jī)體腫瘤監(jiān)視體系的主要成員。通過釋放γ干擾素、顆粒酶B和穿孔素等腫瘤毒性細(xì)胞因子，腫瘤免疫細(xì)胞能夠殺傷腫瘤細(xì)胞。然而，腫瘤患者的體內(nèi)，這套腫瘤免疫機(jī)制是失效的，何種原因造成這種情況目前尚不清楚。有一種觀點(diǎn)認(rèn)為:患者體內(nèi)對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐受性造成腫瘤免疫抑制狀態(tài)，而這種耐受是腫瘤特異性調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)介導(dǎo)的［2］。然而，這種腫瘤特異性調(diào)節(jié)T細(xì)胞是如何產(chǎn)生的并不清楚。

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptors，EGFR)在細(xì)胞的生長、分化和生存等方面均有重要作用［3］。NSCLC、乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌均可見到EGFR的過度表達(dá)，而且通常是預(yù)后不良的指標(biāo)之一［4-5］。盡管針對(duì)EGFR的靶向藥物在晚期NSCLC治療中的重要地位已確立多年［6］，其具體機(jī)制仍未完全闡明。

表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)除了能促進(jìn)細(xì)胞增殖外，還有其他作用［7］。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)是體內(nèi) EGF的主要來源之一［8］。由于DC在一定條件下能誘導(dǎo)產(chǎn)生調(diào)節(jié)T細(xì)胞，我們猜測(cè)DC能夠捕獲NSCLC細(xì)胞表達(dá)的EGFR，轉(zhuǎn)化為免疫耐受型DC，進(jìn)而誘導(dǎo)生成腫瘤特異性調(diào)節(jié)T細(xì)胞。為驗(yàn)證該想法，我們提取NSCLC腫瘤標(biāo)本中的外泌體(exosome)，檢測(cè)顯示其含有EGFR，通過外泌體誘導(dǎo)DC轉(zhuǎn)化為免疫耐受型，后者誘導(dǎo)生成的調(diào)節(jié)T細(xì)胞對(duì)腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞有強(qiáng)大抑制作用。

1 材料與方法

1.1 試劑 吲哚胺2，3-二氧酶抗體(IDO;H11)，EEA1抗體(E-8)及EGFR抗體(A-10)購自 Santa Cruz公司中國上海分部。熒光素標(biāo)記的CD25抗體(2A3)及Foxp3抗體(259D/C7)購自BD Bioscience公司中國上海分部。免疫細(xì)胞提純?cè)噭┖匈徸訫yltenyi Biotech公司中國上海分部。顆粒酶B及穿孔素的免疫組化檢測(cè)試劑盒購自R＆D Systems公司中國上海分部。

1.2 肺組織標(biāo)本 在我院深低溫肺組織標(biāo)本庫中抽取30份石蠟病理已證實(shí)的NSCLC組織標(biāo)本作為研究對(duì)象，另有10份非腫瘤(COPD及自發(fā)性氣胸)肺組織標(biāo)本作為對(duì)照。組織標(biāo)本獲取途徑為手術(shù)切除及穿刺活檢。

1.3 外泌體純化 按Cho等［9］的文獻(xiàn)方法進(jìn)行外泌體提取和純化，簡述如下:將肺組織標(biāo)本研磨為勻漿，在4℃下 100 000 r·min-1高速離心 1 h，取上清;將上清液加1 ml PBS緩沖液重懸浮后再次100 000 r·min-1高速離心1 h;棄上清，將沉淀溶于50 μl PBS緩沖液重懸浮后備用。

1.4 Western免疫印跡 將已純化的外泌體進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素轉(zhuǎn)移膜，5%脫脂牛奶封閉30 min，加入一抗室溫孵育1 h，用Tris緩沖吐溫20鹽水(Tris-buffered saline-Tween 20，TBTS)洗脫3次。加入二抗繼續(xù)室溫孵育1 h，最后加入免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑(ECL reagent)并進(jìn)行X射線顯像。

1.5 外泌體免疫染色 按文獻(xiàn)報(bào)道方法［10］進(jìn)行下述步驟:將純化后的外泌體與2%多聚甲醛在微量離心管中固定2 h;沖洗后加入一抗(1 mg·L-1)室溫下孵育1 h，再加入二抗繼續(xù)孵育1 h;將染色后的外泌體涂片后置于共焦顯微鏡下觀察。

1.6 免疫細(xì)胞提取 免疫細(xì)胞由外周血中提取獲得:外周血經(jīng)過梯度離心獲得單個(gè)核細(xì)胞，后者經(jīng)過磁性細(xì)胞分選進(jìn)一步獲得所需的免疫細(xì)胞。具體操作遵循所購試劑盒指南。

1.7 未成熟DC的培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)液中加入5 mg·L-1粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，將此前獲得的CD14+CD11c-細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)6 d。培養(yǎng)結(jié)束后通過臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)證實(shí)所獲DC活性超過90%。

1.8 流式細(xì)胞分析 2%多聚甲醛固定2 d，磷酸緩沖鹽水沖洗3次以后，取熒光標(biāo)記抗體(0.5～1 mg·L-1)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。再次以磷酸緩沖鹽水沖洗3次，將細(xì)胞置于流式細(xì)胞儀下進(jìn)行分析。

1.9 T細(xì)胞增殖評(píng)價(jià) 將獲得的Th0細(xì)胞用琥珀酰亞胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE)進(jìn)行標(biāo)記，在RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液中加入10 mg·L-1提取的腫瘤蛋白提取物、調(diào)節(jié)T細(xì)胞和DC進(jìn)行共培養(yǎng)。4 d后通過流式細(xì)胞儀分析，CFSE稀釋法進(jìn)行細(xì)胞增殖評(píng)價(jià)。每個(gè)樣本至少分析50 000個(gè)細(xì)胞。

1.10 免疫耐受型DC的培養(yǎng) 未成熟的DC在含有10 mg·L-1外泌體環(huán)境下培養(yǎng)7 d，IDO+DC比率通過流式細(xì)胞儀分析。培養(yǎng)結(jié)束后通過臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)證實(shí)DC活性超過90%。

1.11 調(diào)節(jié)T細(xì)胞的培養(yǎng) 將獲得的IDO+DC與CD3+CD4+CD25-Th0細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加入5 mg·L-1白介素-2，培養(yǎng)7 d后用流式細(xì)胞儀分析CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞的比率。

2 結(jié)果

2.1 外泌體EGFR檢測(cè) 經(jīng)過免疫組織化學(xué)染色后的純化外泌體在共焦顯微鏡下觀察，NSCLC樣本中的EGFR陽性率為80%，而對(duì)照肺組織陽性率僅為2%(Fig 1 A-D)。Western免疫印跡結(jié)果與之一致(Fig 1 E)。該結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞生成的EGFR能夠通過外泌體形式排出細(xì)胞外。

2.2 EGFR+外泌體誘導(dǎo)免疫耐受DC 外泌體可能具有局部及遠(yuǎn)程免疫調(diào)節(jié)作用［11-12］，我們進(jìn)一步觀測(cè)純化后的外泌體是否能夠調(diào)節(jié)DC。按文獻(xiàn)報(bào)道方法［13］，由健康志愿者外周血單核細(xì)胞獲得的DC與外泌體共培養(yǎng)7 d后，80%DC呈現(xiàn)IDO表達(dá)(Fig 2B)明顯高于對(duì)照組(Fig 2A)。用抗體封閉EGFR能終止其對(duì)IDO+DC的誘導(dǎo)(Fig 2C、2F)。該結(jié)果提示EGFR+外泌體能夠誘導(dǎo)免疫耐受IDO+DC產(chǎn)生。

EGFR能激活磷脂酰肌醇三激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)，進(jìn)而產(chǎn)生后續(xù)的生化效應(yīng)［14］，而PI3K與IDO表達(dá)密切相關(guān)［15］。我們推測(cè)EGFR+外泌體也是通過該途徑誘導(dǎo)IDO+DC產(chǎn)生的，為驗(yàn)證該想法我們?cè)谂囵B(yǎng)液中加入PI3K抑制物，而DC的IDO表達(dá)果然受阻。該結(jié)果提示EGFR+外泌體誘導(dǎo)IDO+DC是通過PI3K介導(dǎo)的。

Fig 1 EGFR in exosomes

2.3 免疫耐受型DC誘導(dǎo)腫瘤特異性調(diào)節(jié)T細(xì)胞由于IDO+免疫耐受型DC能夠誘導(dǎo)調(diào)節(jié)T細(xì)胞［16］，因此由EGFR+外泌體誘導(dǎo)生成的IDO+DC應(yīng)該也具備誘導(dǎo)生成調(diào)節(jié)T細(xì)胞的能力。為驗(yàn)證該想法，我們將CD3+CD4+CD25-T細(xì)胞與前述獲得的IDO+DC共培養(yǎng)7 d。結(jié)果顯示CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為了調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Fig 3)。為了檢驗(yàn)所獲的調(diào)節(jié)T細(xì)胞是否具有腫瘤抗原特異性，我們將分選獲得的CFSE標(biāo)記的調(diào)節(jié)T細(xì)胞與腫瘤純化蛋白及DC共培養(yǎng)3 d。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示:20%的調(diào)節(jié)T細(xì)胞對(duì)腫瘤蛋白抗原出現(xiàn)了增殖反應(yīng)(Fig 4B)。而將非腫瘤肺組織蛋白替換腫瘤蛋白后對(duì)調(diào)節(jié)T細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)則未觀察到這種增殖反應(yīng)(Fig 4C)，提示這種調(diào)節(jié)T細(xì)胞的增殖是具有腫瘤特異性的。

2.4 EGFR+外泌體誘導(dǎo)的輔助T細(xì)胞抑制腫瘤蛋白特異性CD8+T細(xì)胞 輔助T細(xì)胞的主要作用是抑制其他效應(yīng)T細(xì)胞的功能。為了檢驗(yàn)上述誘導(dǎo)生成的腫瘤特異性輔助T細(xì)胞是否具有免疫抑制作用，我們將其與腫瘤患者的CD8+T細(xì)胞按9∶1、6∶1和3∶1比例進(jìn)行共培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)液中同時(shí)加入腫瘤純化蛋白和DC。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，CD8+T細(xì)胞增殖15%，培養(yǎng)液中同時(shí)可檢測(cè)到抗腫瘤介質(zhì)穿孔素和顆粒酶B(圖)。而對(duì)照組未觀察到CD8+T細(xì)胞增殖或抗腫瘤介質(zhì)。這些結(jié)果顯示，外周血中的特異性CD8+T細(xì)胞仍然具有抗腫瘤功能，但這種功能被輔助T細(xì)胞所抑制，并且這種抑制呈現(xiàn)數(shù)量依賴性。

Fig 2 EGFR+exosomes induce IDO+DCs

Fig 3 Generation of Tregs.

3 討論

包括NSCLC在內(nèi)的許多腫瘤細(xì)胞均能表達(dá)EGFR［17］，本研究顯示NSCLC腫瘤組織中獲取的外泌體含有大量EGFR。外泌體能夠攜帶特定分子，從細(xì)胞中釋放出去，再被其他細(xì)胞捕獲，從而調(diào)節(jié)該細(xì)胞的功能。有研究顯示上皮細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體中帶有整合素αvβ6及其抗原，后者被DC捕獲并轉(zhuǎn)化為免疫耐受型DC［11］。與該研究類似，我們的結(jié)果顯示NSCLC產(chǎn)生的外泌體同樣可被DC捕獲，后者產(chǎn)生了免疫耐受分子IDO。IDO在誘導(dǎo)輔助T細(xì)胞產(chǎn)生及免疫耐受［18］和腫瘤免疫逃避［19］方面發(fā)揮著重要作用。由于DC能夠產(chǎn)生內(nèi)皮生長因子，而外泌體中含有EGFR，我們推測(cè)是內(nèi)皮生長因子與其受體的相互作用激活DC，進(jìn)而產(chǎn)生IDO。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這個(gè)猜想:在DC培養(yǎng)液中加入EGFR特異性抗體進(jìn)行預(yù)處理，IDO的產(chǎn)生被阻斷了。此外，通過PI3K抑制劑阻斷IDO信號(hào)傳導(dǎo)通路同樣也能阻斷DC產(chǎn)生IDO。

Fig 4 Generated Tregs are tumor antigen specific

誘導(dǎo)生成輔助T細(xì)胞是免疫耐受型DC的主要功能。He等［20］研究提示干擾素γ激活的DC能分泌轉(zhuǎn)化生長因子β，具有免疫耐受性，并能誘導(dǎo)輔助T細(xì)胞生成。Park等［21］通過口服抗原誘導(dǎo) IDO+DC產(chǎn)生，進(jìn)而誘導(dǎo)產(chǎn)生輔助T細(xì)胞，后者能抑制關(guān)節(jié)炎樣炎癥反應(yīng)。既往研究顯示免疫耐受型DC可誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤特異性輔助T細(xì)胞，本研究結(jié)果與之一致，并進(jìn)一步證實(shí)這些輔助T細(xì)胞具有腫瘤抗原特異性。由于目前對(duì)腫瘤抗原的定義尚未統(tǒng)一［22］，本研究也未確認(rèn)腫瘤抗原的具體成分，但可以確定的是我們?cè)谘芯恐惺褂玫哪[瘤蛋白含有腫瘤抗原。誘導(dǎo)生成的輔助T細(xì)胞能夠在含腫瘤蛋白的培養(yǎng)液中增殖，這表明這些細(xì)胞具有腫瘤抗原特異性。

Fig 5 Tregs suppress tumor-specific CD8+T cells

本研究還顯示生成的輔助T細(xì)胞能抑制腫瘤抗原特異性CD8+T細(xì)胞。在沒有輔助T細(xì)胞情況下，提純出的CD8+T細(xì)胞能在含腫瘤蛋白培養(yǎng)液中增殖，這顯示這些增殖細(xì)胞具有腫瘤抗原特異性。此外，我們還在培養(yǎng)液中檢測(cè)到抗腫瘤分子顆粒酶B、穿孔素。這些證據(jù)顯示在NSCLC患者體內(nèi)，仍然存在功能正常的抗腫瘤CD8+T細(xì)胞，而這些抗腫瘤CD8+T細(xì)胞被腫瘤抗原特異性輔助T細(xì)胞所抑制。這些證據(jù)顯示，腫瘤抗原特異性輔助T細(xì)胞在機(jī)體抗腫瘤免疫中起重要作用。

總之，本研究顯示:NSCLC細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體中含有大量EGFR，DC能捕獲這些外泌體并轉(zhuǎn)化為免疫耐受型，進(jìn)而誘導(dǎo)生成腫瘤抗原特異性輔助T細(xì)胞，后者能抑制NSCLC特異性CD8+T細(xì)胞。

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