饒進(jìn)軍，何關(guān)生，毛 楠，鐘小懿，呂 琳，王文雅

(1.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州 510515;2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州 510260;3.廣州市番禺中心醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州 511400)

EZH2(enhancer of zeste homolog2)為多梳基因(polycomb group genes，PcG)蛋白家族的主要成員之一，是H3組蛋白第27位賴氨酸(H3K27)的特異性甲基化轉(zhuǎn)移酶，調(diào)節(jié)組蛋白H3的甲基化，對(duì)基因沉默和轉(zhuǎn)錄抑制發(fā)揮重要作用［1］，其突出的作用是致INK4a/ARF基因座啟動(dòng)子H3K27me3形成，從而抑制P14ARF、P16INK4a的表達(dá)，維護(hù)細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖。近年來發(fā)現(xiàn) EZH2在前列腺癌 、乳腺癌和膀胱癌［2-4］等多種惡性腫瘤中存在高表達(dá)，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。靶向EZH2的研究發(fā)現(xiàn)，沉默該基因具有良好的抗腫瘤作用，并且能逆轉(zhuǎn)肝癌對(duì)氟尿嘧啶的耐藥性［5］，被認(rèn)為是一個(gè)很有前景的抗癌新靶點(diǎn)。

肺癌是當(dāng)前發(fā)病率最高的腫瘤，且對(duì)化療藥物極易產(chǎn)生耐藥性，是嚴(yán)重危害人類健康的一類惡性腫瘤［6］?；陧樸K的聯(lián)合化療是目前肺癌的一線治療方案，對(duì)于EZH2是否可以作為逆轉(zhuǎn)肺癌對(duì)順鉑的耐藥性目前尚未明了。本研究以RNA干擾技術(shù)對(duì)此進(jìn)行了研究，并進(jìn)一步對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了探討。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株 人非小細(xì)胞型肺癌A549細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù);人非小細(xì)胞型肺癌順鉑耐藥株A549/DDP由第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院呼吸疾病研究所惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑 順鉑(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.9%，批號(hào):1001620597)購(gòu)自 Sigma公司;Lipofectamine RNA imax、TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司 ;細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、AnnexinV FITC-/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;兔抗人EZH2(D2C9)、H3K27me3(C36B11)單克隆抗體、山羊抗兔IgG-二抗購(gòu)自CST公司;兔抗人P14、E2F1多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司;兔抗人 P16(EP435Y)、P53(E26)、Rb(C84F6)、CDK1(E53)、CDK2(Q265)、P21(EPR362)、β-actin(EPR6255)單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green Real-time PCR Master Mix購(gòu)自日本 Toyobo;PCR引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成;siRNA由廣州銳博生物科技有限公司合成;其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與干預(yù) 肺癌A549細(xì)胞及其順鉑耐藥株A549/DDP常規(guī)培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為0.10胎牛血清的F12K培養(yǎng)基中。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)轉(zhuǎn)染組(EZH2-siRNA)、無關(guān)序列對(duì)照組(Negative-siRNA)和空白組(lipofectamine)。轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞按照每孔0.5×104細(xì)胞濃度接種96孔板，每孔1.0×105細(xì)胞接種6孔板，確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞達(dá)到50%匯合度，按照lipofectamine RNA imax說明分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)EZH2 mRNA的表達(dá) TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA，按試劑盒說明書將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以各組cDNA作為模板，在ABI 7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。EZH2上游引物 5'-GTTGGCGGAAGCGTGTAAAATC-3'，下游引物 5'-TCCCTAGTCCCGCGCAATGAGC-3';以 GAPDH為內(nèi)參，上游引物 5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3'，下 游 引 物 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。 用 2-△△Ct法 計(jì) 算EZH2/GAPDH比值。

2.3 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組轉(zhuǎn)染siRNA，各組轉(zhuǎn)染48 h后，分別提取細(xì)胞總蛋白，以BCA法測(cè)其濃度。采用SDS-PAGE電泳分離總蛋白后，半干法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，BSA溶液室溫封閉1 h后，一抗4℃孵育過夜;PVDF膜以TBST溶液洗滌5 min×3次后，二抗室溫孵育1 h;TBST溶液洗膜5 min×3次后，采用ECL發(fā)光試劑盒顯色，X線片壓片后曝光成像。

2.4 MTT法檢測(cè)A549/DDP細(xì)胞的增殖能力檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化:實(shí)驗(yàn)前24 h按1 500/孔的細(xì)胞濃度將A549/DDP接種于96孔板，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組轉(zhuǎn)染siRNA，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，加 MTT(5 g·L-1)10 μl/孔，4 h 后吸出孔內(nèi)液體，加入 DMSO 150 μl/孔，震蕩10 min后，檢測(cè) 570 nm處吸光度OD值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

檢測(cè)細(xì)胞順鉑敏感性變化:種板及轉(zhuǎn)染處理方法同上，24 h后更換含終濃度分別為 0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μmol·L-1順鉑的 F12K 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，MTT法檢測(cè)。細(xì)胞存活率/%=各濃度組吸光度值/空白組吸光度值×100%，并繪制曲線，計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

2.5 PI染色法檢測(cè)細(xì)胞周期分布 根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組轉(zhuǎn)染siRNA，各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，PBS洗滌，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)·L-1后，用體積分?jǐn)?shù)為0.7的乙醇固定，4℃保存過夜，PBS洗去固定液后，加入 500 μl PI染色液，37℃避光 30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.6 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組轉(zhuǎn)染siRNA，各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，取2×105個(gè)細(xì)胞，加入195 μl結(jié)合液重懸細(xì)胞后，加入5 μl AnnexinV-FITC混勻，室溫避光孵育10 min后，離心，棄上清。加入190 μl結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，加入 10 μl PI，混勻，于1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.7 β-半乳糖苷酶染色 根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，6孔板上轉(zhuǎn)染siRNA，48 h后用PBS洗滌細(xì)胞1次，每孔加入1ml染色固定液，于室溫固定15 min，用PBS洗滌細(xì)胞3 min×3次，每孔加入1 ml染色工作液，37℃孵育過夜。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞衰老現(xiàn)象。

3 結(jié)果

3.1 A549/DDP細(xì)胞中EZH2表達(dá)明顯高于A549細(xì)胞 結(jié)果如Fig 1所示，耐藥細(xì)胞株A549/DDP中EZH2的mRNA水平和蛋白表達(dá)水平均高于親本株A549。siRNA轉(zhuǎn)染48h后，與空白組(C)、Neg-siRNA陰性對(duì)照組(N)相比，轉(zhuǎn)染EZH2-siRNA 01、02、03序列的A549/DDP細(xì)胞中EZH2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯下降，表明轉(zhuǎn)染組序列對(duì)EZH2的干擾均有效，其中02序列EZH2-siRNA沉默效果最佳，選為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干擾序列。

3.2 沉默EZH2對(duì)A549/DDP細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果見Tab 1，EZH2-siRNA組細(xì)胞凋亡率與空白組、Neg-siRNA組相比，差異均無顯著性(P＞0.05)。表明沉默EZH2并沒有明顯誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞發(fā)生凋亡。

Tab 1 Flow cytometric analysis on apoptosis of A549/DDP cells 48h after transfection(±s，n=3)

Tab 1 Flow cytometric analysis on apoptosis of A549/DDP cells 48h after transfection(±s，n=3)

Apoptotic rate/%24 h 48 h 72 h A549/DDP 5.4±1.7 5.7±2.4 3.9±3.2 Neg-siRNA 4.4±1.3 3.9±1.5 5.6±1.3 EZH2-siRNA 3.7±1.4 4.8±1.3 5.3±1.7

3.3 沉默EZH2表達(dá)后明顯增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性 結(jié)果如Fig 2，與Neg-siRNA組和空白組相比，EZH2-siRNA組A549/DDP對(duì)順鉑的敏感性明顯增加，IC50值由(41.2±4.3)μmol·L-1下降為(19.4±3.3)μmol·L-1(P＜0.01)。

3.4 沉默EZH2誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞周期G1/S阻滯 結(jié)果見Fig 3、Tab 2，與空白組、Neg-siRNA組相比，EZH2-siRNA作用后，G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加，S期、G2/M期細(xì)胞明顯減少，表明細(xì)胞發(fā)生了G1/S期阻滯。

Tab 2 Flow cytometric analysis on cell cycle of A549/DDP cells 48h after transfection(±s，n=3)

Tab 2 Flow cytometric analysis on cell cycle of A549/DDP cells 48h after transfection(±s，n=3)

*P＜0.05 compared with A549/DDP and Neg-siRNA

Cell cycle distribution/%G0/G1phase S phase G2/M phase A549/DDP 52.9±7.8 14.8±4.3 32.8±5.1 Neg-siRNA 52.4±6.6 15.3±4.6 32.3±4.4 EZH2-siRNA 83.7±8.6* 11.4±3.5* 4.7±2.1*

3.5 沉默EZH2對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)了沉默EZH2后，細(xì)胞周期G1/S相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，結(jié)果如 Fig 4所示，沉默EZH2可上調(diào)P21表達(dá)，下調(diào)CDK1、CDK2的表達(dá)，提示EZH2可能通過調(diào)控上述周期相關(guān)基因的表達(dá)而影響細(xì)胞周期進(jìn)程。

Fig 2 Effect of silencing EZH2 expression on cisplatin chemoresistance

Fig 3 Effect of EZH2-siRNA on cell cycle distribution of A549/DDP cells

3.6 沉默EZH2可明顯誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞衰老

結(jié)果如 Fig 5所示，siRNA轉(zhuǎn)染48 h后，鏡下可見EZH2-siRNA組A549/DDP細(xì)胞出現(xiàn)明顯的衰老形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為細(xì)胞體積變大、扁平、胞內(nèi)顆粒增多，β-半乳糖苷酶染色呈陽性(藍(lán)染);而空白組與Neg-siRNA組細(xì)胞未見衰老改變。

3.7 沉默EZH2對(duì)H3K27me3以及細(xì)胞衰老相關(guān)基因表達(dá)的影響 siRNA靶向沉默EZH2后，對(duì)細(xì)胞衰老通路 P14ARF、P16INK4a、P53、Rb、E2F1 及組蛋白H3K27me3表達(dá)水平有明顯影響。如Fig 6所示，沉默EZH2可明顯下調(diào)E2F1、H3K27me3蛋白表達(dá)，上調(diào) P14ARF、P16INK4a、P53、Rb 蛋白表達(dá)，說明沉默EZH2可激活I(lǐng)NK/ARF/Rb細(xì)胞衰老通路，誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。

Fig 6 Effect of EZH2-siRNA transfection on expression of H3K27me3，P14ARF，P16INK4a，P53，Rb and E2F1 in A549/DDP cells

4 討論

與一般的多藥耐藥不同，腫瘤對(duì)順鉑形成耐藥的機(jī)制非常復(fù)雜，是一個(gè)多因素綜合作用的結(jié)果，主要包括維護(hù)細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)通路、細(xì)胞骨架變化、DNA修復(fù)系統(tǒng)、細(xì)胞的外排及吸收等環(huán)節(jié)，幾乎囊括了細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的每個(gè)環(huán)節(jié)。

目前發(fā)現(xiàn)直接參與調(diào)節(jié)對(duì)鉑類耐藥的基因如HSP、GSHases、ATP7A/B、CTR1、ERCC1 等就有數(shù)10種之多。此外，還有如miR196、miR200c等10多個(gè)miRNA介入其中，它們間既有相互協(xié)同，又往往獨(dú)立產(chǎn)生耐藥作用。所以，單獨(dú)作用于某一個(gè)致耐藥因素并沒有令人滿意的效果，目前，也還沒有合適的作用靶點(diǎn)用于逆轉(zhuǎn)肺癌對(duì)鉑類藥物耐藥性［7-8］。

近年的研究發(fā)現(xiàn)，抵御化療藥物誘導(dǎo)衰老是腫瘤細(xì)胞的一大特性，也是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性的重要機(jī)制之一［9］。細(xì)胞衰老是指在致衰老因素作用下，細(xì)胞周期受到阻滯，細(xì)胞喪失了對(duì)分裂原的反應(yīng)，處于失去增殖分化能力的狀態(tài)，是一種不可逆的生物學(xué)變化。細(xì)胞衰老后仍具有基本的代謝能力，能維持一段時(shí)間存活，但形態(tài)上和功能上會(huì)發(fā)生明顯變化:細(xì)胞體積變大，可見異染色灶的形成，會(huì)出現(xiàn)顆粒樣的“衰老色素”(溶酶體對(duì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞成分自吞噬后形成的殘余物質(zhì))。由于衰老細(xì)胞溶酶體內(nèi)容物增多，導(dǎo)致β-半乳糖苷酶的水平明顯增高，通過染色可呈現(xiàn)特異的藍(lán)色，這些特征也都是目前鑒別衰老細(xì)胞的主要標(biāo)志。細(xì)胞一旦發(fā)生衰老，也就失去抵御化療藥物作用的能力。有鑒于此，對(duì)抗腫瘤多藥耐藥性不一定非要直接殺死腫瘤細(xì)胞，可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，降低細(xì)胞對(duì)藥物的抵御能力，從而產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)耐藥的效果。

誘導(dǎo)細(xì)胞衰老主要有INK4a/ARF/Rb通路［10］，INK4a/ARF編碼兩個(gè)重要的腫瘤抑制基因P16INK4a與P14ARF，分別通過調(diào)節(jié)Rb和P53產(chǎn)生誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的作用。P16INK4a是周期素依賴性蛋白激酶CDK4、CDK6的抑制者，與CDK4、CDK6結(jié)合后使后兩者發(fā)生蛋白變構(gòu)，失去了與D型細(xì)胞周期蛋白結(jié)合的能力，喪失了介導(dǎo)Rb磷酸化的作用，致使Rb處于低磷酸化狀態(tài)，促進(jìn)Rb與E2F的結(jié)合，減少E2F的釋放，使細(xì)胞終止在G1期，誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。P14ARF通過與MDM2結(jié)合，抑制P53的泛素化，從而抑制P53降解，促進(jìn)P53的作用，使P21表達(dá)增多，引起細(xì)胞周期G1/S阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。

如前所述，INK4a/ARF受PcG調(diào)節(jié)，PcG基因是一類高度保守的基因，主要作用是維持同源異形基因沉默。PcG蛋白致基因沉默是由PRC1(polycomb repressive complex 1)、PRC2(polycomb repressive complex 2)2個(gè)多聚抑制復(fù)合物完成的，PRC1核心蛋白有 Bmi1、Ring1、PH1和CBX;PRC2核心蛋白有 EZH2、eed、SUZ12和 RBAP48。首先，PRC2通過其催化亞基 EZH2的 SET結(jié)構(gòu)域(在 eed、SUZ12的協(xié)同下)對(duì)核小體組蛋白H3的27號(hào)賴氨酸進(jìn)行甲基化修飾，形成H3K27me3，這種甲基化作用建立起染色質(zhì)和PcG蛋白質(zhì)氨基端的連接點(diǎn)，使PRC1獲得募集，通過CBX與H3K27me3相互作用使PRC1錨定在染色質(zhì)上，進(jìn)而Ring1、Bmi1又使組蛋白H2A-K119泛素化;H2A-K119泛素化使得染色質(zhì)處于收緊狀態(tài)，從而抑制轉(zhuǎn)錄因子與DNA的作用以及抑制轉(zhuǎn)錄的延伸。PRC2/PRC1對(duì)INK4a/ARF基因的沉默已被證實(shí)具有維護(hù)細(xì)胞增殖/存活，抑制細(xì)胞衰老及分化的作用。

EZH2在胚胎干細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，而干擾抑制其表達(dá)后，會(huì)解除PcG對(duì)INK4a/ARF的抑制，引發(fā)細(xì)胞發(fā)生衰老。而在恢復(fù)PcG的功能后，也觀察到衰老細(xì)胞又重新呈現(xiàn)幼稚化的現(xiàn)象。在呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、血液系統(tǒng)及婦科腫瘤中都發(fā)現(xiàn)EZH2的異常高表達(dá)，現(xiàn)已被一些腫瘤治療作為愈后好壞的一個(gè)重要指標(biāo)［11］。

在卵巢癌中，EZH2被認(rèn)為與順鉑耐藥有關(guān)［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于非小細(xì)胞肺癌，順鉑耐藥株A549/DDP的EZH2的表達(dá)在mRNA和蛋白水平上均較其親本細(xì)胞株A549有明顯增高，以siRNA沉默耐藥株中EZH2的表達(dá)后，能明顯增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，表明EZH2基因的過表達(dá)與肺癌順鉑耐藥密切相關(guān)，EZH2是一個(gè)潛在的逆轉(zhuǎn)肺癌順鉑耐藥性的新作用靶點(diǎn)。與通常的抗腫瘤靶點(diǎn)不同，沉默EZH2并不能明顯而快速地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或壞死，這一發(fā)現(xiàn)與在卵巢癌中觀察到的現(xiàn)象一致，表明作用于EZH2逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥性存在其它的作用機(jī)制。

鑒于沉默EZH2后G0/G1期細(xì)胞比例明顯增高，S期細(xì)胞明顯降低，表明細(xì)胞周期發(fā)生了G1/S期阻滯，而這一作用是通過誘導(dǎo)P21，下調(diào)CDK1、CDK2實(shí)現(xiàn)的。隨后的研究證實(shí)，干擾EZH2的表達(dá)后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞發(fā)生了明顯的衰老樣變，表明沉默EZH2誘導(dǎo)了細(xì)胞衰老。

先前的研究已證實(shí)，EZH2可上調(diào)H3K27me3，抑制INK4a/ARF基因座的表達(dá)。如Fig 6所示，本研究沉默 EZH2表達(dá)，可明顯下調(diào)細(xì)胞中H3K27me3和E2F1蛋白表達(dá)，上調(diào)P14ARF、P16INK4a、P53、Rb蛋白。由此推斷，沉默 EZH2后激活I(lǐng)NK4a/ARF/Rb通路，誘導(dǎo)細(xì)胞衰老是沉默EZH2表達(dá)后逆轉(zhuǎn)A549/DDP細(xì)胞順鉑耐藥性的一個(gè)重要作用機(jī)制。

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