張麗靜，張蕾蕾，黃文華，高 麗，霍小位，劉冬羽，李立勇，曹 麗

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，北京 100193)

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計2003～2007年，中國胃癌發(fā)病率居惡性腫瘤第2位［1］。目前尚無特效藥物，因此，有效藥物的發(fā)現(xiàn)迫在眉睫。目前，臨床抗腫瘤藥物的60%來源于植物、海洋生物及微生物類的天然產(chǎn)物［2］。雷公藤(Triptergium wilfordiiHook.f)是衛(wèi)矛科一年生藤本植物，是我國傳統(tǒng)醫(yī)學中的常用中草藥。有研究表明其具有抗炎以及抗腫瘤等活性［3］。雷酚萜甲醚(triptonoterpene methyl ether，TME)是從雷公藤的根皮提取物中分離得到的二萜類化合物。有研究發(fā)現(xiàn)，TME對人宮頸癌HeLa細胞和小鼠成纖維細胞L929具有抑制作用，表明TME具有潛在抗腫瘤活性，但其抗腫瘤機制沒有進一步的研究報道［4］。

本課題使用多種腫瘤細胞篩選TME抑制細胞增殖的活性，結果顯示TME對人胃癌AGS細胞的抑制作用明顯，并且對正常人胃上皮細胞GES-1的增殖抑制作用較弱，因此，對TME抑制人胃癌AGS細胞的增殖作用及機制進行了進一步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥物 雷酚萜甲醚(C12H30O3)由中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所黃文華老師提供。用二甲基亞砜(DMSO)溶解，配成濃度為20 mmol·L－1的儲備液，－20℃保存，使用前用培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，其中 DMSO終濃度 ＜0.1%。陽性藥紫杉醇(辰欣藥業(yè)公司，H20057404)使用前用培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。

1.1.2 細胞株 人胃癌細胞株AGS由中國農(nóng)業(yè)大學封文海教授饋贈，正常人胃上皮細胞GES-1購自中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院。

1.1.3 主要試劑 Ham's F12培養(yǎng)基、MTT、β-actin抗體購自美國Sigma公司;DMEM培養(yǎng)基、青霉素鏈霉素混合液、胰蛋白酶購自Gibco公司，胎牛血清購自四季青公司。Annexin-FITC/PI試劑盒購自北京寶賽生物技術有限公司。JC-1染料和活性氧DCFH-DA探針購自美國Invitrogen公司。Bax、Bcl-2、PARP抗體購自美國 Santa Cruz公司。Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8抗體購自美國 Cell Signaling Technology公司，山羊抗鼠 IgG-HRP和山羊抗兔IgG-HRP購自北京中杉金橋公司。AO/EB、DMSO、PI購自美國Amresco公司。

1.1.4 主要儀器 BCN-1360型生物潔凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司);5410型二氧化碳培養(yǎng)箱(NAPCO，美國);MQX200型酶標儀(Bio-Tek，美國);CKX41倒置熒光顯微鏡(Olympus，日本);Labofuge 400R離心機(Heraeush，德國);流式細胞分析儀(Becton-Dickinson，CA)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) AGS細胞和GES-1細胞分別用Ham's F12和DMEM培養(yǎng)基(添加10%的胎牛血清和1%的青、鏈霉素混合液)于37℃，在5%CO2條件下培養(yǎng)，細胞長至培養(yǎng)瓶80%時傳代，取處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 MTT實驗 將處于對數(shù)生長期的AGS細胞和GES-1細胞分別以每孔6 000個的濃度接種于96孔板，24 h后加入100 μl不同濃度的TME，濃度分別為 5.68、11.36、22.73、45.45、90.91 μmol·L－1。分別作用 24、48、72、96 h 后，每孔加 10 μl MTT(5 g·L－1)，繼續(xù)作用4 h后，棄掉上清液，并加入200 μl DMSO溶解反應產(chǎn)物，用酶標儀在570 nm波長處檢測吸光值(absorbance，A)，計算細胞存活率。存活率/%=100%－(A陰性對照－A藥物組)/A藥物組×100%。根據(jù)所得的TME 5個濃度梯度的細胞存活率繪制曲線，計算在4個不同作用時間點下TME誘導細胞凋亡50%時的濃度，即IC50值。

1.2.3 光學顯微鏡對細胞形態(tài)觀察 取106個對數(shù)生長期細胞接種于6孔板，24 h后加入不同濃度(7.58、15.15、30.30 μmol·L－1)的 TME 作用 24 h后，吸出培養(yǎng)液，PBS洗2次。每孔加入1 ml PBS，光學顯微鏡下觀察。

1.2.4 熒光顯微鏡下AO/EB雙染法檢測細胞凋亡 取105個對數(shù)生長期細胞接種于24孔板，培養(yǎng)24 h 后加不同濃度(7.58、15.15、30.30 μmol·L－1)的TME作用24 h后，吸出培養(yǎng)基，用PBS洗2次。每孔加入100 μl AO/EB混合染液，在熒光顯微鏡下觀察拍照?？梢钥吹交罴毎顺示G色熒光;凋亡細胞核呈橘紅色熒光［5］。

1.2.5 平板克隆實驗 將對數(shù)生長的細胞用胰酶消化吹打至單細胞懸液后，加入6孔板內(nèi)，每孔100個細胞，輕搖培養(yǎng)板使細胞分散均勻，24 h后加不同濃度 (3.79、7.58、15.15、30.30、60.61 μmol·L－1)的TME靜置培養(yǎng)1～2周。當培養(yǎng)板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。吸去上清液，用PBS洗2次。加純甲醇固定15 min后，用蒸餾水洗2次。結晶紫染色20 min后，用蒸餾水緩慢洗去染色液，室溫干燥后進行觀察，拍照。

1.2.6 流式Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測細胞凋亡率 取106個對數(shù)生長期細胞接種于6孔板，加不同濃度(7.58、15.15、30.30 μmol·L－1)的TME作用24 h后收集細胞，PBS洗細胞2次，將細胞重懸于 200 μl Binding Buffer中，加入 10 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育 15 min，加入 300 μl Binding Buffer和 5 μl PI，使用 FACSort流式細胞儀檢測細胞凋亡比率。

1.2.7 活性氧檢測 取106個對數(shù)生長期細胞接種于 6 孔板，不同濃度(7.58、15.15、30.30 μmol·L－1)的 TME 作用24 h 后收集細胞，1 500 r·min－1離心5 min，用PBS洗3次后重懸，加入DCFH-DA熒光探針，室溫下避光染色30 min，離心棄去上清，用PBS洗2遍，用FACSort流式細胞儀檢測細胞內(nèi)活性氧水平的變化。

1.2.8 線粒體膜電位的檢測 取106個對數(shù)生長期細胞接種于6孔板，加不同濃度(7.58、15.15、30.30 μmol·L－1)的 TME 作用 24 h 后收集細胞，1 500 r·min－1離心 5 min，用無血清 Ham's F12 培養(yǎng)基洗3次，重懸細胞，加入JC-1原液，使其最終作用濃度為 2 μmol·L－1，37 ℃避光孵育 30 min 后離心，棄去上清液，用PBS洗2次，流式細胞儀檢測細胞內(nèi)線粒體膜電位的變化。

1.2.9 Western blot 取106個對數(shù)生長期細胞接種于 6 孔板，不同濃度(7.58、15.15、30.30 μmol·L－1)的TME作用24 h后，收集細胞，提取蛋白。取40 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳1 h，電泳結束后電轉55 min，將PVDF膜用5%的脫脂奶粉于室溫封閉2 h，封閉一抗4℃過夜后，用TBST洗3次，每次10 min，封閉二抗在室溫下孵育2 h，TBST洗3次，每次10 min，顯色液進行顯色后使用凝膠成像儀(BIO-RAD)進行成像。使用photoshop圖像處理軟件對蛋白條帶的灰度值進行分析，將β-actin作為內(nèi)參，用目的條帶與β-actin條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.2.10 細胞周期檢測 取106個對數(shù)生長期細胞接種于 6 孔板，不同濃度(7.58、15.15、30.30 μmol·L－1)TME 分別作用 24、48、72 h后，收集細胞，1 500 r·min－1離心 5 min，PBS 洗 3 次，加入 1 ml體積分數(shù)為0.75的乙醇(－20℃預冷)，混勻，－20℃過夜固定。1 500 r·min－1離心5 min，PBS洗3次，加入500 μl PI(終濃度50 mg·L－1)避光染色10 min后，用流式細胞儀檢測細胞周期。

2 結果

2.1 TME對細胞增殖抑制的時效、量效作用 如Fig 1所示，MTT結果顯示，隨著TME濃度增加和作用時間的延長，對AGS細胞的抑制作用增強，具有時間和劑量依賴性，TME作用24、48、72、96 h時的IC50分別為 43.03、23.85、22.55、18.33 μmol·L－1。根據(jù)細胞抑制率和細胞狀態(tài)的變化，選擇48 h作為與人正常胃上皮GES-1細胞作用相對照的時間點，此時 AGS 細胞的 IC50值為 23.85 μmol·L－1，TME 同樣作用48 h 的 GES-1 細胞 IC50為 68.85 μmol·L－1。

Fig 1 TME inhibits the proliferation of gastric cancer cells and normal gastric epithelial cells

2.2 TME對AGS細胞形態(tài)及克隆形成的影響普通光學顯微鏡下觀察，在Fig 2A中，隨著TME濃度的增加，AGS細胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)改變，染色質濃縮、核碎裂、細胞核邊緣不整，同時細胞數(shù)量隨之減少。AO/EB染色結果如Fig 2B所顯示，未加藥組大部分細胞呈綠色熒光。TME作用24 h后，隨著劑量的增加，橘紅色熒光細胞明顯增加，同時細胞數(shù)量也有所減少。如Fig 3所示，隨著TME濃度的增加，TME抑制AGS細胞的克隆形成的作用明顯增強。

Fig 2 Morphological changes of AGS cells after TME tretment for 24 h

2.3 流式檢測細胞凋亡 Annexin V-FITC/PI染色后，可檢測出不同細胞群即:正常細胞群、早期凋亡細胞群、晚期凋亡和壞死細胞群。TME作用24 h后，誘導細胞發(fā)生凋亡，并隨著TME濃度的增加，細胞凋亡率也有所增加，在 TME 30.30 μmol·L－1濃度時，凋亡率達到對照的4.18倍。見Fig 4A。

Fig 3 TME inhibits clone formation of AGS cells on flat plates for 10 d

2.4 TME對細胞活性氧的影響 DCFH-DA探針可穿過細胞膜被酯酶水解生成DCFH。細胞內(nèi)的活性氧可以將無熒光的DCFH轉化為有熒光的DCF［6］。因此，DCF的熒光強度可以反映細胞內(nèi)活性氧的水平［7］。在檢測結果中，隨著TME濃度的增加，細胞內(nèi) ROS水平也升高，藥物濃度在30.30 μmol·L－1時活性氧水平是空白對照組的1.71倍。見Fig 4B。

2.5 TME降低細胞線粒體膜電位 JC-1染料可反映線粒體膜電位，正常細胞線粒體膜電位高，JC-1聚集在線粒體基質中呈橘紅色熒光。細胞受到損傷后膜電位下降，JC-1將出現(xiàn)綠色熒光的單體形式。Fig 5顯示，對照組呈紅色熒光，細胞線粒體膜電位較高，隨TME濃度的增加綠色熒光逐漸增強，線粒體膜電位下降。與此相一致，流式細胞儀檢測結果表明，隨著TME濃度增加，對應綠色熒光強度的細胞比例從5.48%增加到34.99%，對應紅色熒光強度的細胞群有所減少。

Fig 4 Cell apoptosis and reactive oxygen species production were detected by flow cytometry

Fig 5 TME reduces mitochondrial membrane potential in AGS cells for 24 h

2.6 TME對凋亡蛋白的影響 如Fig 6A所示，TME作用于AGS細胞24 h后，與對照組相比，活化的caspase-8和caspase-3表達增加，同時caspase-3的底物PARP蛋白被剪切活化。在Fig 6B中加入caspase廣譜抑制劑z-VAD-fmk后，抑制了caspase-3和caspase-8的表達。在Fig 6C中可看到，促凋亡蛋白Bax的表達明顯增加，而抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達明顯下降。

2.7 TME對AGS細胞周期的影響 實驗結果顯示，作用24 h后，TME對細胞周期無明顯影響;作用48、72 h后，G0/G1期細胞所占的百分比增加，提示TME可使AGS胃癌細胞阻滯于G0/G1期。見Fig 7。

Fig 6 Effect of TME on the expression of apoptosis related proteins in AGS cells

Fig 7 Effects of TME on AGS cell cycle distribution for 24 h，48 h and 72 h

3 討論

雷公藤是衛(wèi)矛科植物雷公藤(T.Wilferdii)的根，至今已從中分離出多種有效成分，主要有生物堿類、二萜類、三萜類，其中二萜類如雷公藤甲素和三萜類成分如雷公藤紅素均具有明顯的抗腫瘤作用［8］。體內(nèi)外的研究表明，雷公藤甲素為廣譜腫瘤抑制劑，約可以抑制60種腫瘤細胞株，其中以直腸癌細胞株和乳腺癌細胞株最為敏感［9］。雷酚萜甲醚(TME)與雷公藤甲素同屬松香烷型的二萜類單體［10］，但對其抗腫瘤活性少有報道。

在本研究中，我們首先比較了TME對人胃癌細胞AGS和人正常胃上皮組織細胞GES-1的增殖抑制作用。結果顯示，TME對腫瘤細胞的抑制作用明顯高于對正常細胞，提示TME對胃癌細胞的增殖抑制作用較強。

通過細胞形態(tài)觀察、AO/EB染色、克隆形成實驗、AV/PI檢測細胞凋亡率、線粒體膜電位以及活性氧的變化，可觀察到TME能夠明顯誘導AGS細胞發(fā)生凋亡。

目前研究表明，凋亡對腫瘤的抑制起到重要的作用［11］。當細胞通過外源性途徑發(fā)生凋亡作用時，死亡信號通過細胞表面的信號分子傳遞到caspase-8并將其激活，繼而引起caspase-3的激活，從而引起凋亡。Western blot結果顯示，TME作用后能活化caspase-8和 caspase-3，同時剪切 caspase-3底物PARP。預先加入caspase廣譜抑制劑z-VAD-fmk作用后，caspase-3和caspase-8的表達均有所降低。

Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中已知的重要凋亡調控蛋白。前者抑制細胞凋亡，后者促進細胞凋亡。近年研究顯示，調節(jié)細胞凋亡不僅取決于Bcl-2和Bax自身表達的高低，還與二者的比值有關［12］。本研究顯示，TME能降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，增加促凋亡蛋白Bax的表達，從而促進細胞凋亡。

細胞增殖和凋亡水平的改變常與細胞周期調控的變化有關。細胞周期沿著G1、S、G2、M 期的順序有序地運轉［13］。G1期是啟動細胞周期循環(huán)的關鍵，其運轉狀態(tài)是多種疾病的發(fā)病基礎，也是藥物發(fā)揮治療作用的切入點［14］。本實驗顯示，TME可以使AGS細胞停滯于G1期，阻止其向S期及M期轉化，從而使腫瘤細胞生長緩慢并降低其增殖活性。

因此，TME通過作用于Bcl-2家族蛋白而誘導胃癌AGS細胞發(fā)生了凋亡，并使細胞停滯于G1期，降低腫瘤細胞的增殖活性。TME可以作為一個潛在抗胃癌藥物先導化合物，對其作用機制做進一步的研究。

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